改进的胸苷激酶基因制造技术

提供了编码改进的单纯疱疹病毒胸苷激酶的核酸序列，包括它们在诊断和治疗应用中的用途。可以使用保守突变、非保守突变或二者使胸苷激酶突变。还提供了基因治疗系统，包括病毒和逆转录病毒颗粒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的胸苷激酶基因交叉引用本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请号61/784,901的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。本申请涉及以下共同未决的专利申请：与本申请同日提交的申请序列号[尚未指定]，代理卷号30863-722.202，该申请通过引用全文并入本文。
技术介绍
增殖性疾病如癌症对社会构成了严峻挑战。癌性生长，包括恶性癌性生长，具有独特的特征，例如不可控的细胞增殖(其导致，例如恶性组织的不受调控的生长)，入侵局部以及甚至远端组织的能力，缺乏分化，缺乏可检测的症状，以及最显著的是，缺乏有效的治疗和预防。癌症可在任何年龄在任何器官的任何组织中发展。癌症的病因学尚未被明确地界定，但诸如遗传易感性、染色体断裂病症、病毒、环境因素和免疫失调等机制均已与恶性细胞生长和转化相关联。癌症包括一大类别的医学状况，影响到全球数百万的个人。癌细胞可能出现在身体的几乎任何器官和/或组织中。在世界范围内，每年超过1千万人被诊断出患有癌症，并且据估计到2020年，这一数字将增加至每年1500万新发病例。癌症导致每年600万例死亡或全世界死亡数的12％。
技术实现思路
本文提供了编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:1或3的多核苷酸序列相比是突变的。一种编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:3的多核苷酸序列相比是突变的。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167、168或其组合处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基168处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在再另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基167和168处突变成极性、非极性、碱性或酸性氨基酸。在一个实施方案中，编码的HSV-TK的氨基酸残基167突变成丝氨酸或苯丙氨酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK的氨基酸残基168突变成选自组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸的氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸25和26处突变。在再另一个实施方案中，氨基酸残基25和26突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基32和33处突变。在一个实施方案中，氨基酸残基32和33突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32和33处突变。在另一个实施方案中，氨基酸残基25、26、32和33突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。在又另一个实施方案中，编码的HSV-TK包含选自氨基酸残基25、26、32和33的至少一个突变和选自氨基酸残基167和168的至少一个突变。在另外其他的实施方案中，编码的HSV-TK序列进一步包含核输出信号(NES)。在另一个实施方案中，该核输出信号序列在HSV-TK序列的5’末端处或附近插入。在另一个实施方案中，该核输出信号序列是LQKKLEELELDG(SEQIDNO:24)。在一个实施方案中，编码的突变HSV-TK并不仅仅定位于核区域。在一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK显示与野生型HSV-TK相比降低量的胸苷激酶活性。在另一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK的活性降低大约1.5倍、大约2倍、大约5倍、大约10倍、大约20倍、大约30倍或大约50倍。在又一个实施方案中，编码的修饰HSV-TK的活性降低大约1.5％、大约2％、大约5％、大约10％、大约20％、大约30％、大约40％、大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或大约100％。在一个实施方案中，编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32、33和168处包含突变。在另一个实施方案中，编码的HSV-TK包含突变R25G、R26S、R32G、R33S和A168H。在一个实施方案中，修饰的多核苷酸序列包含如SEQIDNO:12-22中的任一个所示的核酸序列。在又一个实施方案中，修饰的多核苷酸序列包含如SEQIDNO:16-22中的任一个所示的核酸序列。在一个实施方案中，该序列包含TK168dmNES(SEQIDNO:18)。在又一个实施方案中，该多核苷酸编码修饰的HSV-TK多肽。在另外其他的实施方案中，该多核苷酸进一步包含编码第二多肽的多核苷酸序列，其中所述第二多肽是治疗性多肽。在另外其他的实施方案中，该第二治疗性多肽是第二自杀基因或生长因子。在一些实施方案中，该生长因子选自表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF、TGF-α、TGF-β和成纤维细胞生长因子。在一些实施方案中，该第二自杀基因选自：胞嘧啶脱氨酶、VSV-tk、IL-2、硝基还原酶(NR)、羧基酯酶、β-葡糖醛酸酶、细胞色素p450、β-半乳糖苷酶、白喉毒素A-链(DT-A)、羧肽G2(CPG2)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和脱氧胞苷激酶(dCK)。在一些实施方案中，所述多核苷酸进一步包含编码PiT-2多肽的多核苷酸。在另外其他的实施方案中，本文公开的多核苷酸还包含编码靶向多肽的多核苷酸。在一个实施方案中，该靶向多肽与胞外蛋白质结合。在另一个实施方案中，该胞外蛋白质是胶原蛋白。本文还提供了杀伤有需要的受试者中的肿瘤细胞的方法，该方法包括施用治疗有效量的逆转录病毒颗粒，该逆转录病毒载体编码如本文所述的HSV-TK修饰的肽。在一些实施方案中，所述逆转录病毒颗粒经静脉内、肌内、皮下、动脉内、肝动脉内、鞘内、腹膜内和/或肿瘤内施用。在其他实施方案中，该逆转录病毒颗粒经肿瘤内或静脉内施用。在另外其他的实施方案中，该逆转录病毒载体颗粒经动脉内施用。在其他实施方案中，向有需要的受试者累积施用至少1×1012TVP的逆转录病毒载体。在另外其他的实施方案中，向有需要的受试者一次施用至少1×109TVP的逆转录病毒载体。在另外其他的实施方案中，所述前药在所述逆转录病毒载体颗粒施用后约1-2天之间施用。在一些实施方案中，该前药选自更昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦。在一些实施方案中，该前药是更昔洛韦。本文还提供了用于治疗有需要的患者中的癌症的方法，该方法包括递送治疗有效量的逆转录病毒载体颗粒，该逆转录病毒载体编码如本文所述的HSV-TK修饰的肽，随后向该有需要的患者施用核苷前药。本文还提供了在受试者中增加HSV-TK更昔洛韦、缬更昔洛韦、阿昔洛韦、伐昔洛韦、喷昔洛韦介导的肿瘤细胞杀伤的方法，该方法包括连同增加间隙连接细胞内通信(GJIC)的处理一起，向该受试者递送治疗有效量的包含HSV-TK的逆转录病毒载体颗粒。在一些实施方案中，该增加GJIC的处理包括递送编码至少一个间隙连接亚单位的多核苷酸序列。在其他的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码来自人单纯疱疹病毒(HSV‑TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV‑TK在氨基酸残基25、26、32、33、167、168或其组合处突变，其中该多核苷酸序列与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列相比是突变的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 61/784,9011.一种用于增加细胞杀伤活性的编码来自人单纯疱疹病毒(HSV-TK)的突变形式的胸苷激酶的多核苷酸序列，其中所编码的HSV-TK在氨基酸残基32和33以及168处突变，其中该多核苷酸序列与SEQIDNO:1的多核苷酸序列相比是突变的，其中氨基酸残基32和33突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸，其中所编码的HSV-TK的氨基酸残基168突变成选自苯丙氨酸和组氨酸的氨基酸，且其中所述突变形式的胸苷激酶相对于野生型胸苷激酶增加细胞杀伤活性。2.根据权利要求1所述的多核苷酸序列，其中所述编码的HSV-TK的氨基酸残基167突变成苯丙氨酸。3.根据权利要求1所述的多核苷酸序列，其中所述编码的HSV-TK包含氨基酸残基25和26突变。4.根据权利要求3所述的多核苷酸序列，其中氨基酸残基25和26突变成选自甘氨酸、丝氨酸和谷氨酸的氨基酸。5.根据权利要求1所述的多核苷酸序列，其中所述编码的HSV-TK在氨基酸残基25、26、32和33处突变。6.根据权利要求1所述的多核苷酸序列，其中所述编码的HSV-TK序列进一步包含核输出信号。7.根据权利要求6所述的多核苷酸序列，其中所述核输出信号序列在所述HSV-TK序列的5’末端处或附近插入。8.根据权利要求6所述的多核苷酸序列，其中所述核输出信号序列是LQKKLEELELDG(SEQIDNO:24)。9.根据权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述编码的突变HSV-TK并不仅仅定位于核区域。10.根据权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸序列，其中所述编码的修饰HSV-TK显示出与野生型HSV-TK相比降低的量的胸苷激酶活性。11.根据权利要求10所述的多核苷酸序列，其中所述编码的修饰HSV-TK的胸苷激酶活性降低1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍。12.根据权利要求10所述的多核苷酸序列，其中所述编码的修饰HSV-TK的活性降低1.5％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。13.根据权利要求5所述的多核苷酸序列，其中所述编码的HSV-TK包含突变R25G、R26S、R32G、R33S和A168H。14.根据权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·P·利维，R·A·里德，约瑟夫·麦克纳尔蒂，罗伯特·G·约翰逊，
申请(专利权)人：伊佩尤斯生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US