经遗传修饰的家畜动物，以及制造和使用它们的方法，所述动物包括遗传修饰以破坏选择性参与配子发生的靶基因，其中对所述靶基因的破坏阻止所述动物的功能性配子的形成。创建具有供体遗传材料的后代的动物，以及制造和使用它们的方法。具有遗传修饰以破坏选择性参与配子发生的靶基因的细胞，以及制造和使用所述细胞的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 对相关申请的交叉引用 本申请要求2013年5月31日提交的美国临时申请号61/829,672和2013年8月27日 提交的美国临时申请号61 /870，558的优先权，其各自通过提述并入本文。 政府支持声明 本文所述工作的方面由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health) 的基金1R43RR033149-01 Al和USDA-美国国立粮食和农业研究所(National Institute of Food and Agriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号2012-33522-19766支持。 美国政府可以拥有这些专利技术的某些权利。
本
涉及创建经遗传修饰的动物，例如，具有配子发生基因敲除的家畜动 物。 背景 家畜通常通过有性繁殖创建并使用传统的放牧和饲养方法，或通过集约化的养殖 方法在农场养育到性成熟，其中后者对于猪越来越普遍。对于农场主来说有性繁殖是一种 有成本效益和有效率的过程。 专利技术概述 本专利技术的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含遗传修饰以破坏 选择性地参与配子发生的靶基因，其中所述靶基因的破坏阻止所述动物功能性配子的形 成。 本专利技术的一个实施方案是制备家畜动物细胞的方法，包括向选自家畜细胞和家畜 胚胎的生物体引入试剂，所述试剂特异性结合细胞的染色体靶位点并导致双链DNA断裂来 破坏基因，来选择性破坏配子发生，其中所述试剂选自下组:靶向性核酸内切酶，RNA，重组 酶融合蛋白。 本专利技术的一个实施方案是体外细胞，包含特异性结合所述细胞的染色体靶位点并 导致双链DNA断裂来破坏基因从而选择性破坏配子发生的试剂，所述试剂选自下组:靶向性 核酸内切酶和重组酶融合蛋白。本专利技术的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，包含对Y染色体的基因组修饰， 其中所述修饰包括插入，删除，或取代所述染色体的一个或多个碱基。 本专利技术的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包含染色体上的外源 基因，所述基因在配子发生中选择性活化的基因表达元件的控制下。 本专利技术的一个实施方案是经遗传修饰的动物，包括遗传不育的雄性家畜动物，其 产生功能性的供体精子而不产生功能性的天然精子。 本专利技术的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括染色体上的外源 基因，所述基因表达控制所述动物后代性别的因子，其中所述动物产生仅一种性别的后代。 本专利技术的一个实施方案是畜群，包含复数个的所述动物。 以下专利申请再次通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明 书为准：US 2010/0146655，US 2010/0105140，US 2011/0059160,和US 2011/0197290。 附图简述 图1是制造和使用遗传不育动物来传播供体基因的方法的图解。 图2是通过在配子发生期间由Y染色体表达因子来控制性别和生育力的方法的图 解。 图3A描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3'UTR的microRNA控制。图3B描述了用于破坏配子发生的基因，其表达由结合3'UTR的microRNA和后期精 子发生启动子控制。图4描述了修饰脊椎动物Y染色体的实验结果。图5是实施例6和7的实验结果的图组，示出了CRIPR/Cas9介导的HDR用于将来自疣 猪的P65S531P突变基因渗入到常规的猪中。组a)S531P错义突变；组b)对转染的长白猪 (Landrace)成纤维细胞的SURVEYOR试验；组c和d)示出了对第3天和第10天取样的细胞的 RELP分析。组a中顶部和底部的序列行为向导RNA(gRNA)(具有SEQ ID N0:1的P65_G1S和具 有SEQ ID N0:2的P65_G2A)。第二行为野生型(Wt)P65序列，SEQ ID N0:3。第三行为实验中 使用的HDR模板，SEQ ID NO:4。示出了左TALEN(SEQ ID NO:5)和右TALEN(SEQ ID NO:6)。 图6是实验结果的图组，示出了TALENs和CRISPR/Cas9介导的HDR在猪APC的比较。 组a)描述了 APC 14.2TALENS和相对于野生型APC序列的gRNA序列APC 14.2Gla。下方，示出 了HDR寡聚物，其递送4bp插入(下划线文本)产生新的HindIII位点。组b)示出了展示RFLP和 SURVEYOR试验结果的图表。组a的顶行是APC 14.2TALENS序列，SEQ ID N0:7。第二行是野生 型APCS序列，SEQ ID N0:8。第三行示出了gRNA序列Gla，SEQ ID N0:9。底部序列是HDR模板， SEQ ID N0:10〇 图7示出了使用TALENs和质粒同源性模板，基因靶向脊椎动物Y染色体两个位点 (AMELY和SRY)。使用同源臂外的基因座特异性引物和同源模板内的转基因特异性引物筛选 集落个体集落。所述同源模板的基因座和方向在它们对应的孔上指示而阳性对照指示为 ⑴。图8表格示出了使用TALENs和质粒同源性基因盒的克隆中Y靶向的分析结果。图9是泛素 EGFP对Y染色体中的3个位点的短同源性靶向。有和没有TALENs时，针对 SRY的3'接合处(junction)的引物也给出了非特异性条带模式。图10柱状图示出了使用对AMELY和SRY位点特异性的TALENs和短同源模板处理的 细胞中EGFP标志物的表达。图11是对表达EGFP标志物的克隆的接合分析。图12是实验结果的图组，示出了具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪。组a)是 对分别从DAZL-和APC-修饰的长白猪和Ossabaw成纤维细胞衍生的克隆小猪的RFLP分析。组 b)是序列分析，确认在八个DAZL建立者(founder)中的三个以及六个APC建立者中的六个中 HDR等位基因的存在。供体模板(HDR)中的阻断突变(意图抑制HDR等位基因的再切割)标在 方框中，而插入的碱基圈出。顶部WT序列中加粗的字体指示TALEN结合位点。组c)提供了 DAZL(左）和APC(右）建立者动物的照片。有14行比对序列，其中每一行分别为编号SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:24的独立序列。图13是图像的显微照片图组，示出了缺乏精子发生并没有精子细胞的DAZL敲除 (KO)猪。组a是来自睾丸内部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，其示出了精原细胞的完全不存 在。组b是来自睾丸外部的DAZL KO曲细精管的H&E染色，也示出了精原细胞的完全不存在。 组c使用了泛素羧基末端水解酶LI(UCH-LI)，一种存在于野生型猪睾丸中的精原细胞标志 物。组d中，UCH-LI不存在于DAZL KO睾丸中，指示精原细胞的不存在。组e中，乙酰化的a-微 管蛋白存在于野生型猪睾丸的曲细精管中，指示精原细胞的存在。组f中，DAZL KO猪的曲细 精管是乙酰化a-微管蛋白阴性的，证明了这些动物中精子细胞的缺乏。 专利技术详述 本文列出了实施方案以制造和使用遗传不育动物，或能够产生仅一种性别的后代 的动物。如本文所列出的遗传不育动物以及用于创造它们的简易技术的可用性提供了产生 经遗传修饰的动物和常规家畜的新方法和新的机会。一些实施方案涉及将供体组织置于本文档来自技高网...
【技术保护点】
经遗传修饰的家畜动物，所述动物包括遗传修饰以破坏选择性参与配子发生的靶基因，其中对所述靶基因的破坏阻止所述动物中功能性配子的形成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：DF卡尔森，SC法伦克鲁格，
申请(专利权)人：重组股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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