在有效生产对映体富集的醇中用于酮的对映体选择性还原的设计师细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供制备各种重组全细胞生物催化剂，在本文称为“设计师细胞”，具有显著增强的羰基还原酶活性，用于有效生产各种工业重要的对映体富集的醇。更具体地，该醇是光学纯的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，它作为生产羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的手性结构单元和中间体是有用的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在对映体富集醇的高效生产中的全细胞生物催化剂以及其应用。更具 体地，本专利技术涉及在本文称为"设计师细胞"的全细胞生物催化剂的研发，它具有以高对映 体过量的各种酮到它们的醇的不对称还原具有显著增强的转化率。具体地，本专利技术涉及对 于由式1表示的4-氯乙酰乙酸乙酯到生产由式2表示的4-氯-3-羟基丁酸乙酯以>99. 9 % 对映体过量的有效转化、具有增强的转化率转化率的设计师细胞的研发，4-氯-3-羟基丁 酸乙酯作为生产羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂的手性结构单元和中间 体是有用的。
技术介绍
在现有技术中，已经描述了使用从各种来源分离的野生型全细胞生物催化 剂制备包括（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业重要的光学活性醇的方法实例，各种 来源诸如白地霉（Geotrichumcandidum) (Sundby,E.等人，JournalofMolecular CatalysisB:Enzymatic2003, 21，63 - 66)、近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis) (Kaliaperumal,T.等人，JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology 2010, 37, 159-165)、木兰假丝酵母（Candidamagnoliae) (Yasohara,Y.等人，Applied MicrobiologyandBiotechnology1999,51,847-851)、柱抱霉病菌（Cylindrocarpon sclerotigenum)(Saratani,Y.等人.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry 2001，65, 1676-1679)、乳酸克鲁维酵母（Kluveromyceslactis) (Yamamoto,H.，等人， Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry2002, 66, 1775-1778)、埃利氏克鲁维氏 酉孝母(Kluyveromycesaestuarii) (Yamamoto,H.等人，Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry2004, 68, 638-649)、出芽短梗霉菌（Aureobasidiumpullulans) (He,J. Y.等人，ProcessBiochemistry2006, 41，244 - 249)、树干毕赤酵母（Pichiastipitis) (Ye,Q.等人，BiotechnologyLetters2009, 31,537-542)、和天蓝链霉菌（Streptomyces coelicolor) (Wang,L.J.等人BioresourceTechnology2011, 102, 7023-7028)。而且， 用野生型全细胞生物催化剂生产（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法已在以下公开：美国 专利第99/5891685号、美国专利第97/5700670号、美国专利第96/5559030号、美国专利 第95/5413921号、美国专利第90/4933282号和美国专利第87/4710468号。虽然描述使 用野生型微生物来还原羰基至相应的醇的方法存在，但是这些方法具有缺点，诸如，较低 效、较低底物浓度、较低的光学纯度等。因此，使用野生型天然全细胞生物催化剂合成包括 (S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业重要的光学活性醇是不切实际的。 进一步，提高包括（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业重要光学活性 醇的已知方法包括使用从天然来源纯化的酶，像木兰假丝酵母（Wada，M.等人， Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry1998, 62, 280-285)、赫色掷抱 酉孝母(Sporobolomycessalmonicolor) (Kita,K.等人，JournalofMolecular CatalysisB:Enzymatic1999,6,305-313)、乳酸克鲁维酵母（Yamamoto,H.等人， Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry2002,66, 1775-1778)、埃利氏克 鲁维氏酉孝母(Yamamoto,Η.等人，Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry 2004, 68, 638-649)、树干毕赤酵母（Ye,Q.，等人，BioresourceTechnology 2009, 100, 6022-6027)和天蓝链霉菌（Wang,L.J.等人，BioresourceTechnology 2011，102, 7023-7028)。 当具有羰基还原酶活性的纯化酶或转化体包括4-氯-乙酰乙酸乙酯的还原酮的 羰基时，它需要辅酶：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸（NADPH)，用于制备包括（S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业重要光学活性醇。随着反 应的进行，辅酶转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷 酸磷酸（NADP)。在不存在辅因子再生系统情况下，需要化学计量量的广泛辅因子。然而，当 反应在辅因子再生系统的存在下完成时，广泛的辅酶的量大大降低。辅因子再生系统通常 由酶组成，该酶在其底物存在下转化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH)或烟酰胺 腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)成为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)或还原型烟酰胺腺 噪呤二核苷酸磷酸（NADPH)。辅酶再生能力可通过下方式实现：使用纯化酶（Yasohara，Y. 等人，Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry2000, 64, 1430-1436 ；Kaluzna,I. A.等人，JournaloftheAmericanChemicalSociety2004, 126, 12827-12832 ;Zhu,D等 人，TheJournalofOrganicChemistry2006, 71, 4202-4205 ;Ye,Q.等人，Biotechnology Letters2009, 31，537-542)，或使用在细胞质中具有辅酶再生能力的转化体（Xu，Z.等人， AppliedMicrobiologyandBiotechnology2006, 70, 40-46 ；Zhang,J.等人，Chemical Communications2006, 398 - 400)。 诸如利用基因改组技术的体外酶进化的方法已经被用来提高酮还原酶和葡糖 脱氢酶的活性，与相应的野生型酶相比，酮还原酶以约13倍不对称还原4-氯乙酰乙酸 乙酯，葡糖脱氢酶使用葡萄糖底物以约7倍再循环辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP)或还原型烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸（NADPH)(SteveK.Ma等人，GreenChemistry 2010, 12, 81-86 ;美国专利第 10/0028972 号；美国专利第本文档来自技高网...

【技术保护点】
设计师细胞，其在细胞的表面上表达选自序列表的SEQ ID NO:1、3、5或7的序列的非天然出现的羰基还原酶多肽，与在细胞的细胞质中表达序列表的SEQ ID NO:13或15或17或19的相应羰基还原酶的设计师细胞相比，对于式1的4‑氯乙酰乙酸乙酯向式2的(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯的转化，每单位质量的CRS多肽具有250倍至300倍更高的活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：高塔姆·斯里瓦斯塔瓦，桑尼特·考尔，拉文德·辛格·乔利，
申请(专利权)人：科学与工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：印度;IN