胸苷激酶突变体制造技术

本发明专利技术提供了编码Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ胸苷激酶的分离的核酸分子，该分子包含一个或多个突变，其中至少一个所说突变编码一个ＤＲＨ核苷结合位点上游的氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性（与未突变的胸苷激酶比较）。在另一方面，一个所说的突变编码一个ＤＲＨ核苷结合位点内的氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性（与未突变的胸苷激酶比较）。本发明专利技术也提供了适于表达这种ＤＮＡ分子的载体以及使用该载体的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总的来说涉及Herpesviridae突变体酶，更具体地说涉及利用胸苷激酶突变体的组合物和方法。
技术介绍
尽管总的来看细菌性疾病可容易地用抗生素治疗，但对许多病毒性、寄生虫性、癌性和遗传性疾病却很少存在有效的治疗方法。例如，可以经外科切除实体肿瘤(solid tumor)来治疗癌症。然而，大多数有实体肿瘤的病人在主要肿瘤位点之外也具有微小转移灶。若仅外科治疗，则约70％的这类病人会出现癌症复发。因而，在美国，癌症引起的死亡占总死亡的五分之一，居疾病引起的死亡的第二位。此外，现在也用涉及细胞毒化疗药物(如，长春新碱、长春花碱、顺式铂氨、氨甲蝶呤、5-FU等)的疗法和/或放射疗法结合治疗肿瘤。而使用这些方法的困难之一是放疗和化疗剂对正常组织有毒，常常产生危及健康的副作用。另外，这些方法常常具有极高的无效/缓解率(依癌症的类型而变，可高达90％)。已尝试了许多其它方法以支持和加强个体自身的免疫系统，从而消灭肿瘤细胞。例如，某些科学家采用细菌或病毒成分为佐剂，以便刺激免疫系统消灭肿瘤细胞。这些药剂已作为佐剂和非特异性刺激剂在动物肿瘤模型中使用，但还未证实对人体有效。淋巴因子也被用于治疗肿瘤(以及病毒性和寄生虫性疾病)，以便在免疫反应的产生中刺激或影响特异性免疫细胞。例如，一个小组采用淋巴因子白细胞介素-2刺激外周血细胞，以扩增和产生大量对肿瘤细胞为细胞毒性的细胞(Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.3131485-1492，1985)。有人已建议采用特异性单克隆抗体或＂魔弹＂特异性靶向和杀伤肿瘤细胞的抗体介导性治疗(Dillman，＂Antibody Therapy＂，Principles of CancerBiotherapy，Oldham(ed)，Raven Press，Ltd.，New York，1987)。然而，有一个困难是大多数单克隆抗体来源于鼠，因而对鼠抗体的超敏反应可能限制其效率，特别是在重复治疗后。通常的副作用包括发烧、盗汗、畏冷、皮肤疹、关节炎和神经瘫痪。最近已引起极大兴趣的一种方法是使用基因治疗，它不仅已用于治疗遗传性疾病，也已用于治疗病毒性和癌性疾病(参见PCT出版物WO91/02805、EPO415731和WO90/07936)。简单地说，是把得自病毒的特别设计的载体用于将特定的遗传信息传递到细胞中。这种遗传信息本身可以用于阻断损坏的蛋白质或抗原的表达(例如，反义治疗)，可以编码对选择的细胞有毒并杀死选择的细胞的蛋白质，可以编码阻断细胞免疫反应的治疗蛋白质或编码取代失活或非成活的蛋白质的蛋白质。最近推荐用于这种治疗的一种蛋白质是1型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK-1)。简单地说，胸苷激酶是一种磷酸化天然核苷酸底物以及核苷类似物的补救途径酶(参见Balasubramaniam et al.，J.of Gen.Vir.712979-2987，1990)。可以通过将表达这一蛋白质的逆转录病毒引入到细胞中，接着施用核苷类似物(例如，无环鸟苷、ganciclovir)治疗性地使用所述蛋白质。然后，HSVTK-1磷酸化所说的核苷类似物，产生能够杀死宿主细胞的毒性产物。因此，使用表达HSVTK的逆转录病毒载体不仅被建议用于治疗癌症，而且被建议用于其它疾病。本专利技术提供了具有增强的生物学活性的新胸苷激酶突变体，该突变体适于多种用途(例如基因治疗)，并具有其它相关的优点。专利技术概述简单地说，本专利技术提供了利用Herpesviridae胸苷激酶的组合物和方法。本专利技术一方面提供了包含一个或多个突变的编码Herpesviridae胸苷激酶的分离的核酸分子，其中至少一个突变编码一个DRH核苷结合位点上游的氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性(与未突变的胸苷激酶比较)。在本专利技术的另一方面，所说的突变编码一个DRH核苷结合位点内的氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性(与未突变的胸苷激酶比较)。本专利技术另一方面提供了编码包含一个或多个突变的Herpesviridae胸苷激酶的分离的核酸分子，其中至少一个突变是一个DRH核苷结合位点下游(例如，下游4、5或6位核苷酸)的氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性(与未突变的胸苷激酶比较)。本专利技术也提供了适于表达这种DNA分子的载体以及使用该载体的方法。合适的Herpesviridae胸苷激酶的代表性例子包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶和单纯疱疹病毒2型胸苷激酶、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶以及绒猴疱疹病毒、猪疱疹病毒1型、Pseudorabies病毒、马疱疹病毒1型、牛疱疹病毒1型、火鸡疱疹病毒、Marek′s病病毒、疱疹病毒saimiri和EB病毒胸苷激酶。在其它实施方案中，所说的胸苷激酶可以是灵长类疱疹病毒胸苷激酶或非灵长类疱疹病毒胸苷激酶，例如禽疱疹病毒胸苷激酶。本专利技术的内容包含许多种突变。例如在一个实施方案中描述了编码所述DRH核苷结合位点上游1-7位氨基酸的一个或多个氨基酸取代。在一个优选的实施方案中，所述DRH核苷结合位点上游1位的氨基酸被选自缬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸的氨基酸取代。在另一个优选的实施方案中，氨基酸丙氨酸取代存在于所说DRH核苷结合位点上游7位的氨基酸。在另一个实施方案中，谷氨酸可以取代所说DRH核苷结合位点中的天冬氨酸。在另一个实施方案中，组氨酸可以取代所说DRH核苷结合位点中的精氨酸。在另一个实施方案中，所说胸苷激酶是截短的，但仍保留生物学活性。本专利技术的另外的实施方案提供了分离的核酸分子，所说的核酸分子编码一种胸苷激酶，该胸苷激酶能够磷酸化核苷类似物，其磷酸化核苷类似物的能力至少超过野生型胸苷激酶的一倍。在另一个实施方案中，所说的胸苷激酶磷酸化核苷类似物的能力至少超过野生型胸苷激酶的X倍，其中X选自1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。在另一个实施方案中，所说胸苷激酶能够磷酸化核苷类似物，其中Z>]]>式中TKmNAp是胸苷激酶突变体引起的核苷类似物磷酸化率，TKmTp是胸苷激酶突变体引起的胸苷激酶磷酸化率，TKwtNAp是未突变的胸苷激酶引起的核苷类似物磷酸化率，TKwtTp是未突变的胸苷激酶引起的胸苷激酶磷酸化率，Z选自1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5。合适的核苷类似物的代表性例子包括ganciclovir、无环鸟苷、buciclovir、famciclovir、penciclovir、valciclovir、三氟胸苷、1--5-碘尿嘧碇、ara-A、araT 1-(-D-阿糖呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2′-脱氧尿苷、5-碘代-5′-氨基-2，5′-二脱氧尿苷、碘苷、AZT、AIU、二脱氧胞苷和AraC。增加核苷类似物磷酸化的特别优选的突变体胸苷激酶包括其中所说的酶是1型单纯疱疹病毒胸苷激酶，并且其中丙氨酸取代155位脯氨酸，缬氨酸取代161位苯丙氨酸的那些。在另一个实施方案中，异亮氨酸可以取代161位苯丙氨酸，半胱氨酸可以取代161位的苯丙氨酸。本专利技术另一方面提供了由上述核酸分子编码的突变体胸苷激酶以及能够表达这些分子的载体。一方面本专利技术提供了包含可操作连接到本专利技术的核酸分子上的启动子的表达载体。优选的一方面所说载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码包含一个或多个突变的Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ胸苷激酶的分离的核酸分子，至少一个所说的突变是一个ＤＲＨ核苷结合位点下游的５位氨基酸取代，这种取代增加所说胸苷激酶的生物学活性（与未突变的胸苷激酶比较）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LA罗布，ME布莱克，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：US[美国]