一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体，所述的Ppmar1转座酶D332S突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码所述Ppmar1转座酶D332S突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。是将野生型Ppmar1转座酶332位置上的天冬氨酸突变为丝氨酸。该Ppmar1转座酶D332S突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.56倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。

Ppmar1 transposition enzyme D332S mutant with high catalytic activity and application thereof

The invention discloses a high catalytic activity of the Ppmar1 transposase D332S mutant, the amino acid sequence of Ppmar1 transposase mutants of the D332S as shown in SEQ ID NO.1. The nucleotide sequence encoding the Ppmar1 transposase D332S mutant gene is shown as SEQ ID NO.2. Mutation of aspartic acid at position 332 of wild type Ppmar1 transposable enzyme to serine. The Ppmar1 transposase D332S mutant catalytic transposable activity is 2.56 times higher than the wild-type transposase activity, for the use of MLE transposon tag gene development laid the foundation for large-scale genomic era separation and marker gene for gene function research, provides a new tool.

【技术实现步骤摘要】
一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体及其应用。
技术介绍
转座子(transposon)是指在基因组上能从一个位点转移到另一个位点的一段DNA序列。自20世纪40年代美国遗传学家McClintock首先在玉米中发现转座子(Ac/Ds)以来，科学家们发现了多种类型的转座子，它们广泛存在于细菌、酵母和高等动植物中。随着人们在分子水平上对转座子结构和功能认识的不断深化，一些转座子已被改造为基因标签应用于基因分析，并逐渐成为大规模分离基因的重要手段之一。Mariner-Like转座子(Mariner-LikeElements，MLE)是转座子中一个重要家族，最早是在研究毛里塔尼亚果蝇(Drosophilamauristiana)白眼基因的一个不稳定突变时发现的。此后在其他动物以及植物基因组中也发现了大量MLE转座子的存在。与其它转座子相比较，MLE转座子具有结构简单、异源转座率高、在基因组插入位点接近随机等特点，在开发基因标签，分离基因，研究基因功能上，远远优于其他转座子。MLE转座子由两端反向重复序列(TerminalInvertedRepeats，TIRs)和编码转座酶的基因组成，转座酶负责催化转座子转座，因此转座酶的活性是影响转座子的转座频率的主要因素。然而自然界分离的MLE转座酶由于在进化过程中“垂直失活”效应积累了或多或少的突变，部分或全部丧失了催化转座能力，成为低活性或非活性的转座酶，严重影响了MLE转座子的应用，因此人工构建高活性的转座酶就显得十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体及其应用，解决了现有自然界分离的MLE转座酶催化活性较低或者不具备催化活性的问题。本专利技术提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体，所述的Ppmar1转座酶D332S突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种编码所述Ppmar1转座酶D332S突变体的基因，编码所述Ppmar1转座酶D332S突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有编码所述Ppmar1转座酶D332S突变体的基因。本专利技术还提供了一种工程菌株，所述工程菌株携带有上述重组质粒。本专利技术还提供了一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体在构建酵母突变体中的应用。与现有技术相比，本专利技术提供的一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体，具有以下有益效果：本专利技术从毛竹中克隆到的活性转座酶，对其进行人工改造之后获得较高活性的MLE转座酶突变体(Ppmar1转座酶D332S突变体)，Ppmar1转座酶D332S突变体催化转座子转座的活性是野生型转座酶的活性的2.56倍，为利用MLE转座子开发基因标签奠定了基础，为后基因组时代大规模分离和标记基因，研究基因的功能提供了新工具。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及专利技术点，故不对其步骤进行详细描述。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本专利技术另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本专利技术中使用的所有技术和科学术语与本
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
的技术人员对现有技术的掌握及本专利技术的记载，还可以使用与本专利技术实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本专利技术。一、野生型MLE转座酶和去除转座酶的非自主性转座子的获得步骤1.1，采集新鲜的毛竹叶片(Phyllostachyspubescens，采集于浙江农林大学植物园，北纬N30°15′14.67″东经E119°43′33.47″)，利用CTAB法提取毛竹基因组DNA，根据MLE转座子TIR保守序列设计引物Ppmar1-5-3(Ppmar1-5-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，得到MLE转座子扩增产物。PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，1μlPpmar1-5-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，100ng毛竹基因组DNA，加无菌水补齐20μl。PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，60℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。步骤1.2，扩增出序列后，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit试剂盒的方法将步骤1.1的MLE转座子扩增产物连接到pMD18-T载体，测序确认后，命名为Ppmar1转座子，Ppmar1转座子全长序列如SEQIDNO.3所示。步骤1.3，采用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit试剂盒提取毛竹叶片RNA，通过Invitrogen公司的SuperScriptTMVILOTMcDNASynthesisKit试剂盒将RNA反转录为cDNA，根据Ppmar1转座酶序列设计一对引物PpTpase1-5和PpTpase1-3(PpTpase1-5和PpTpase1-3的序列信息见表1)，进行PCR扩增，回收得到Ppmar1转座酶扩增产物，即为Ppmar1转座酶核苷酸序列。PCR扩增的体系为20μl，包括0.2μlrTaqPolymerase(5U/μl)，0.5μlPpTpase1-5(10μmol/L)，0.5μlPpTpase1-3(10μmol/L)，2μl10×rTaqBuffer(Mg2+plus)，1.6μldNTPmix(2.5mmol/L)，10ng毛竹叶片cDNA，加无菌水补齐20μl。PCR扩增的反应条件为：预变性94℃5min；变性94℃30s，55℃30s，延伸72℃40s，35个循环；72℃2min，4℃10min。步骤1.4，采用TaKaRa公司pMDTM18-TVectorCloningKit试剂盒的方法将步骤1.3的Ppmar1转座酶核苷酸序列连接到pMD18-T载体克隆，测序确认，Ppmar1转座酶核苷酸序列和相应的氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。将含有Ppmar1转座子全长序列的pMD18-T载体用BseRI切除Ppmar1中间转座酶的大部分序列。酶切体系为50μl，包括5μl10×buffer，1μlBseRI(1U/μl)，1μg质粒(含有Ppmar1全长序列的pMD18-T载体)，加无菌水补齐50μl，37℃温浴6小时。回收质粒大片段，用T4DNALigase将质粒大片段自连接，得到Ppmar1的非自主性转座子pMD18-T-Ppmar1-Tn(Tn表示非自主性转座子)。其中，自连接的体系为10μl，包括1μl1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体，其特征在于，所述的转座酶D332S突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有高催化活性的Ppmar1转座酶D332S突变体，其特征在于，所述的转座酶D332S突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种编码所述Ppmar1转座酶D332S突变体的基因，其特征在于，编码所述转座酶D332S突变体的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周明兵，汤定钦，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33