本发明专利技术属于生物技术领域。更具体而言，本发明专利技术涉及逆转录酶，其在细菌中表达并纯化，并且具有人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)O组的逆转录酶的氨基酸序列，其中在位置358,359和360处具有修饰；并且本发明专利技术涉及该酶的变体，该变体在位置355和357、或者在478处或者在位置69处(在这种情况下伴有插入2个氨基酸)包含其他的变化。这些聚合酶在高温(高于60℃)下具有比未突变的酶更高的活性。此外，它们在高于70℃的温度下保持了DNA合成的能力。此外，这些酶的复制保真度明与未突变的逆转录不具有明显的差异。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术为生物
更具体而言，本专利技术设及逆转录酶，该逆转录酶在细菌中 表达并纯化，并且具有在多个位置发生修饰的人类免疫缺陷病毒-1型0组化IV-1)的逆转 录酶的氨基酸序列。运些聚合酶在升高的溫度（高于60°c)下比未突变的酶具有更高的活 性。此外，它们在超过70°C的溫度下还保持DNA合成。运些酶的复制保真度与未突变的逆 转录酶不具有显著的差异。
技术介绍
在逆转录病毒中，逆转录酶（RT)为负责复制病毒基因组的酶。RT将单链RNA基因 组转化成能够整合至宿主细胞基因组中的双链DNA中。正是运种聚合酶可W使用RNA或DM作为模板来合成DM。此 夕F，RT还具有核酸内切酶活性（核糖核酸酶H)，运种活性使得RT能够在RNA依赖的DNA合 成过程中降解RNA模板。 阳00引逆转录病毒RT为用于由信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)得到互补DNA(cDNA)的 有用的酶，当通过传统技术（例如PCR)扩增互补DNA时，其可W用于检测基因在有机体或 组织中的表达。RT的效率在许多生物技术的应用中是重要的。例如用于mRNA的检测，通过 实时PCR的定量，使用"微阵列"的基因表达的研究W及使用大规模测序技术的转录组研究 中。但是，RNA中存在二级结构可W降低运些技术的有效性。在升高的溫度下能够合成DNA 的RT得到利用可W用于改良扩增过程中的产率。 由方法学的观点来看，在商业上扩增反应中最常用的RT为禽成髓细胞性白血病 病毒（AMV)、Moloney鼠白血病病毒（MLV) (Cot6andRoth.VirusRes2008 ;1：34:186-202) 的那些，W及人类免疫缺陷病毒1型化IV-1)的RT的变体（在化ziandHersc化orn. VirusRes2008;134:203-220中综述）。AMV和MLVRT是RT-PCR检测中最常用的，但是 AMV的RT在42°C至52°C的溫度范围内具有更好的热稳定性（Gerardetal.NucleicAcids Res. 2002;30:3118-3129)。存在MLVRT的变体，例如AffinityScript(Agilent)或Super ScriptIII(Invitrogen)，它们是市场上出售的在较高的溫度下具有活性的酶（Areziand Hogrefe.NucleicAcidsRes. 2009;37:473-481)。 阳〇化]使用HIV-IRT(分类属于Μ组度亚型））进行的研究证明运些酶比MLVRT具 有更高的活性和热稳定性，但是它们被由系统发生不同且分类属于0组的HIV-1衍生 得到的"野生型"RT变体超越（Aivarczetal.JMolBiol2009;392:872-884;patent W02010130864 (Al))。在用于微管蛋白信使RNA表达中的RT-PCR检测中，MLVRT在超过52°C 的溫度下不能扩增，但是0组或B亚型的"野生型"RT在高达64°C的溫度下是具有活性的， 而且是唯一的首先在 66-68°C下扩增的（A!、arezetal.JMolBiol2009;392:872-884)。 HIV-IRT为由2个亚基组成的异源二聚体，其中一个亚基为560个氨基酸（称为p66)而 另一个亚基为440个氨基酸（称为p51)。p51的序列与p66的氨基酸1-440的序列一致。 HIV-1 0组RT表征为当与B亚型的"野生型"原型比较时，显示出大约20%的氨基酸序列 的差异（Q姐妨瓶如Μ泌euetal.Virology1997 ;236:364-373)。ο组的多种RT表征为比 "野生型"RT具有更高的复制保真度，例如突变V75I，K65R和K65R/V75I的载体。运些RT 在升高的溫度下具有与"野生型"RT所示的相似的热稳定性和催化效率度arrioluengoet al.BiochemJ2011;436:599-607;专利W02012080541(A1))。 专利技术概述 本专利技术设及由人类免疫缺陷病毒1型0组化iv-1)分离得到的并且在一个或多个 位置处修饰的逆转录酶，该逆转录酶比原始的酶具有更高的热稳定性，从而保持了复制保 真度；W及本专利技术设及所述的逆转录酶用于实施核酸模板的逆转录、扩增或测序的用途。 本专利技术的第一个目的设及多肤，该多肤编码了由HIV-1 0组分离得到的具有RT活 性的蛋白质；在高溫下具有较高的稳定性；在超过75°C的溫度下具有比WT酶更高的活性， 从而保持了复制保真度；W及表征为W下氨基酸序列，其与亲代序列SEQIDNO1具有至少 50%-致性并且在其氨基酸序列中在W下的位置处包含多种改变（例如取代、删除和/或 插入）： -与所述的亲代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸（时替代原始氨 基酸赖氨酸化）（突变K358R); -与所述的亲代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸（G)替代原始氨 基酸丙氨酸（A)(突变A359G); -与所述的亲代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸（A)替代原始氨 基酸丝氨酸（S)(突变S360A)。 此外，还描述了其他逆转录酶变体，其包含另外变化成组合K358R/A359G/ S360A(通常全部改变），改良了WTRT的热稳定性，W及在升高的溫度下使用RNA作为模板 合成DNA的能力。运些氨基酸变化和插入属于（例如但未限定本专利技术的范围）W下几组： a)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨 酸（SSG)来替代氨基酸苏氨酸灯）（突变T69SSG); b)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸（A)替代氨基 酸苏氨酸灯）（突变T355A); C)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸（M)替代氨基 酸谷氨酷胺怕）（突变Q357M); d)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酷胺佩替代氨 基酸谷氨酸巧）（E478曲。 作为本专利技术的具体目的，本专利技术包括多种HIV-1 0组逆转录酶的变体，该变体被 用作起点并具有上文所述的突变，并且其中具体的多肤序列相当于SEQIDNO3,SEQID NO5,沈QIDNO7和沈QIDNO9 及它们相应的核巧酸序列（SEQIDNO4,沈QIDNO 6,沈QIDNO8,沈QIDNO10)。 本专利技术的另一个目的为载体，其包含编码本专利技术的逆转录酶的多核巧酸。 本专利技术的另一个目的是包含多核巧酸的细胞，其中所述的多核巧酸编码本专利技术的 逆转录酶。优选地，所述的细胞为细菌，还要更优选地，为大肠杆菌巧scherichiacoli)。 本专利技术的另一个目的是获得本专利技术的多肤的方法，该方法包括W下步骤： 阳021] 1)将本专利技术的载体引入至合适的宿主细胞（本专利技术的宿主细胞）中； 2)在合适的培养基中培养本专利技术的宿主细胞；W及 3)纯化具有RT活性的本专利技术的多肤。 本专利技术的另一个目的设及本专利技术的多核巧酸用于获得具有逆转录酶活性的本发 明的多肤的用途。本专利技术的另一个目的设及本专利技术的宿主细胞用于获得本专利技术的多肤的用途。 本专利技术的另一个目的是本专利技术的多肤在核酸的逆转录、扩增和测序方法中的用 途。其中所述的核本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码具有逆转录酶活性的、由HIV‑1O组分离得到的蛋白质的多肽，其中所述的蛋白质在高温下具有较高的稳定性；在超过75℃的温度下具有高于亲代酶的活性，从而保持了复制保真度；并且特征在于其氨基酸序列与亲代序列SEQ ID NO 1具有至少50％的一致性，并且其至少包含以下的氨基酸变化：‑在与SEQ ID NO 1的位置358同源的位置处，使用氨基酸精氨酸(R)替代原始氨基酸赖氨酸(K)(突变K358R)；‑在与SEQ ID NO 1的位置359同源的位置处，使用氨基酸甘氨酸(G)替代原始氨基酸丙氨酸(A)(突变A359G)；以及‑在与SEQ ID NO 1的位置360同源的位置处，使用氨基酸丙氨酸(A)替代原始氨基酸丝氨酸(S)(突变S360A)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：L·梅嫩德斯阿里亚斯，T·马塔莫罗斯格兰德，D·阿比亚奥尔加多，V·巴瑞奥卢恩戈费尔南德斯，
申请(专利权)人：西班牙高等科研理事会，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。