本发明专利技术公开了一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法，该电化学传感器制备的主要过程是：在二硫化钼纳米片表面依次吸附硫堇、Au@SiO2、富G结构的DNA链S1，通过加入Hemin形成MoS2-Thi-Au@SiO2/DNAzyme纳米复合材料；在金电极表面修饰TS前体，利用端粒酶延长DNA链形成S2，并与S1互补螺旋，最终通过检测催化过氧化氢氧化ABTS的电化学信号强弱来实现对端粒酶活性的直接检测。本发明专利技术制备的电化学传感器操作简单，灵敏度高，稳定性强，对于检测癌变细胞具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体的是一 种基于G-四联体/DNAzyme的检测端粒酶活性的电化学传感器及其制备方法，属于生物检 测
技术介绍
目前，由于人口的老龄化、生态环境的破坏、不健康的生活方式等多方面因素导致 癌症发病率呈逐年上升的趋势，而我国癌症患者的五年存活率仅为30%左右，最根本的原 因是患者确诊为癌症的时候已经处于中晚期，从而耽误了最佳治疗时间。因此，快速、有效 地早期灵敏诊断对于及时发现细胞癌变具有重要意义。 端粒酶在细胞衰老过程中的作用主要有两个方面：一方面，由于大多数正常的人 体细胞中都没有端粒酶活性，因此，端粒的长度将随着细胞的分裂逐渐缩短，使得细胞最终 走向衰老；另一方面，当端粒酶被激活，可以阻止端粒进一步缩短，增加细胞的传代次数。端 粒酶的表达会间接影响细胞的衰老，直接影响细胞走向衰老的是端粒长度的缩短。研宄发 现85%~95%的肿瘤细胞中都可以检测到端粒酶活性，如乳腺癌，结肠癌，淋巴癌，肺癌， 卵巢癌，急性白血病等等，都可以检测到端粒酶活性。因此，端粒酶可以作为一种判断肿瘤 细胞的标识物。目前，检测端粒酶活性最常用的方法是基于PCR扩增技术的TRAP法，专利技术 专利"一种检测端粒酶活性的方法"（专利号02116466. 5)基于PCR技术、通过人类端粒酶 逆转录酶某段结构域的检测来判断端粒酶活性，检测信号稳定性好、可同时对大量样品进 行可重复性操作，但过程复杂，灵敏度低；专利技术专利"一种快速检测端粒酶活性的试剂盒及 其应用"（专利号201210190716. 3)利用核酸外切酶III可以逐步移除双链DNA3'平末端或 3'缩进末端单个核苷酸的特性来测量端粒酶的活性，该方法避免了PCR技术易出现假阳性 或假阴性结果的缺陷，但对端粒酶浓度要求比较高，无法实现对极少量具有端粒酶活性的 癌细胞的检测。 目前我国癌症的诊断主要通过实验室免疫学酶学检测、影像学检测等实现，但昂 贵的检查费用使其在一般健康体检过程中无法普及。而电化学传感器具有操作简单、成本 低廉、灵敏度高和响应速度快等优点，对于癌细胞的早期诊断是一个理想的选择。因此，以 端粒酶为诊断标识物，提供一种用于端粒酶活性检测的电化学传感器对于癌细胞的诊断具 有重要的意义。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种用于检测端粒酶活性的电化 学传感器及其制备方法，有效利用肿瘤细胞中端粒酶被激活的特性，通过电化学工作站对 生物传感器的电信号进行检测，实现了对端粒酶活性的快速、灵敏检测。 为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案： 一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤： (1)将二硫化钼（M〇S2)粉末溶于有机溶剂中，超声剥离后静置，收集上层分散液， 得到单层或几层的二硫化钼的纳米片分散液，取二硫化钼纳米片分散液与硫堇溶液（Thi) 混合，超声，制得硫堇功能化二硫化钼（MoS2-Thi); (2)超声条件下将胶体金溶液逐滴滴入二氧化硅溶液中反应10-20分钟，得到Au@ Si02纳米复合材料溶液； ⑶将步骤⑴的MoS2-Thi纳米复合材料加入到步骤⑵的Au@Si02纳米复合材 料溶液中，室温搅拌反应20-28小时，制得M〇S2-Thi-Au@Si02m米复合材料； (4)设计一条临近5'端富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的DNA链S1，并将5'端硫醇化，使 得S1通过金-硫键修饰到MoS2-Thi-Au@Si02表面；加入氯高铁血红素（Hemin)，使得富G 部分形成G-四联体/DNAzyme，最终制得Sl/MoS2-Thi-Au@Si02/DNAzyme纳米复合材料； (5)将金电极打磨抛光，并将TS前体（端粒酶引物）通过金-硫键修饰到金电极 表面，利用端粒酶将其延伸成富G结构的DNA链S2,并与S1临近3'端非富G部分互补结 合； (6)将步骤（5)处理过的金电极作为工作电极，与参比电极、对比电极连接到电化 学工作站，共同构成能检测端粒酶活性的电化学传感器。 步骤⑴中，所述有机溶剂为N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)、N-乙基-2-吡咯烷酮 (NVP)、异丙醇（IPA)、二甲基亚砜（DMSO)或二甲基甲酰胺（DMF);二硫化钼的纳米片分散液 的质量浓度为20mg?I71，硫堇溶液的摩尔浓度为lmmol?I71;二硫化钼的纳米片分散液与 硫堇溶液加入量的体积比为1:1。 步骤（2)中，所述胶体金溶液中金粒子的粒径为13nm，制备方法为柠檬酸三钠还 原氯金酸法，具体步骤为：将去离子水与1% (W/V)HAuC14溶液按99:1的体积比加入三口 烧瓶中，密封，剧烈搅拌下回流加热，在105°C左右时煮沸，迅速加入2. 5倍去离子水体积 的1% (W/V)柠檬酸三钠溶液，lmin左右时，溶液颜色由淡黄变为深红色，继续回流加热， 20min后停止加热，室温下（23-25°C)搅拌冷却，制得胶体金溶液； 步骤⑵中，所述胶体金溶液与二氧化娃溶液的体积比为1:7 ; 步骤⑵中，二氧化硅溶液的制备方法：将正硅酸乙酯（TE0S)、乙醇、去离子水混 合搅拌10分钟，缓慢加入氨水，保持温度在30°C，不断搅拌，直到形成淡白色溶液，调节pH 到7. 0-7. 5,其中TE0S、乙醇、去离子水、氨水的体积比为1:10:5:3。 步骤（3)中，所述MoS2-Thi纳米复合材料与Au@Si02纳米复合材料加入的体积比 为 1:10〇 步骤（4)中，所述DNA链S1的碱基序列为： 5'-TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCCCTAACCCTAACCCTAA-3'（如序列表中SEQIDNO. 1 所示）； 所述DNA链S1的浓度为1ymol?I71。 步骤（5)中，所述金电极打磨抛光，具体为：将金电极先后用0.5ym和0.03ym的 A1203粉末打磨成镜面，然后用去离子水清洗，再依次置于去离子水和乙醇中超声30-60s; 处理完成后，用0. 5mol?I71的浓硫酸对电极进行循环伏安法活化，直到产生稳定的循环伏 安扫描图，扫描电压为0. 20-1. 65V，扫速为0.lV/s;最后用去离子水冲洗，室温晾干。 步骤（5)中，所述TS前体的碱基序列为： SH-5' -TITITITITTAATCCGTCGAGCAGAGIT-3'（如序列表中SEQIDNO. 2 所示）； 所述TS前体浓度为1ymol?L' 步骤（5)中，所述DNA链S2的碱基序列为： 5' -TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'（如序列表中SEQIDNO. 3 所示）。 步骤（6)中，所述参比电极为甘汞电极，所述对比电极为Pt电极。 采用本专利技术的电化学传感器进行端粒酶活性检测的方法，步骤为： (1)分别将 1、5、10、50、100、200、500、1000、2000、5000 个人早幼粒白血病细胞离 心（lOOOOrpm，5min)、用5mLPBS溶液清洗两次，加入200yL细胞裂解液，冰浴lh，4°C离心 (20000rpm，15min)，取上清液，-80°C保存；取4yL该上清液与6yL的DNA链延长原料缓冲 液混合，并用移液枪吸取滴到电化学传感器的金电极表面，30°C下反应2h，形成S2,用pH= 8. 3的Tris-HC1清洗液冲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测端粒酶活性的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将二硫化钼粉末溶于有机溶剂中，超声剥离后静置，收集上层分散液，得到MoS2的纳米片分散液，取MoS2纳米片分散液与硫堇溶液混合，超声，制得MoS2‑Thi纳米复合材料；(2)超声条件下将胶体金溶液逐滴滴入二氧化硅溶液中反应10‑20分钟，得到Au@SiO2纳米复合材料溶液；(3)将步骤(1)的MoS2‑Thi纳米复合材料加入到步骤(2)的Au@SiO2纳米复合材料溶液中，室温搅拌反应20‑28小时，制得MoS2‑Thi‑Au@SiO2纳米复合材料；(4)设计一条临近5’端富含鸟嘌呤脱氧核苷酸的DNA链S1，并将5’端硫醇化，使得DNA链S1通过金‑硫键修饰到MoS2‑Thi‑Au@SiO2表面；加入Hemin，使得富G部分形成G‑四联体/DNAzyme，制得S1/MoS2‑Thi‑Au@SiO2/DNAzyme纳米复合材料；(5)将金电极打磨抛光，并将TS前体通过金‑硫键修饰到金电极表面，利用端粒酶将其延伸成富G结构的DNA链S2，并与S1临近3’端非富G部分互补结合；(6)将步骤(5)处理过的金电极作为工作电极，与甘汞参比电极、Pt对比电极连接到电化学工作站，共同构成能检测端粒酶活性的电化学传感器。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王宗花，于建波，毕赛，杨敏，张菲菲，夏建飞，桂日军，夏延致，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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