一种抗手足口病药物活性检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，特别涉及一种抗手足口病药物活性检测方法及其试剂盒。该检测方法包括：将编码Gln-Gly的核苷酸序列插入荧光素酶质粒，经体外非细胞转录翻译获得含Gln-Gly的重组荧光素酶；体外重组表达手足口病毒蛋白酶，手足口病毒蛋白酶为2A或3C蛋白酶；手足口病毒蛋白酶与含Gln-Gly的重组荧光素酶、受试物发生酶促反应，检测荧光素的生物发光强度，获得受试物的抗手足口病药物活性。本发明专利技术检测方法具有简单、微量、快速的优点，药物筛选工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于抗手足口病药物的筛选与开发；本法基于萤光素酶的生物发光检测方法，灵敏度高，干扰因素少，受试品兼容性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
，特别涉及一种抗手足口病药物活性检测方法及其试剂盒。
技术介绍
手足口病是由病毒引起的儿科疾病，属于我国法定丙类传染病。0-6岁的婴幼儿是该病的易感人群，其中以2-3岁儿童感染最为常见，患儿感染后首先在四肢及口腔等部位引起疱疹或溃疡，多数患儿给予及时有效治疗后可在1-2周内痊愈。然而，少数患儿病情进展迅速，可在发病1-5天左右出现中枢神经系统和心肺感染，具有较高的致死风险，存活病例仍可留有后遗症。根据世界卫生组织报告，能够引起手足口病症状的病毒大约有20多种，其中以肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirusA16，CoxA16)最为常见，其他能够引起手足口病的病毒主要包括：柯萨奇病毒A组2、4、5、7、9和10型(CoxA2、CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯萨奇病毒B组1-5型(CoxB1-5)以及埃可病毒(ECHO)等。目前，尚没有直接靶向病毒的特效药物或预防性疫苗，临床主要采取对症治疗的策略。这一现状提示药物研发人员仍需要对抗手足口病化合物或组合物深入研究和筛选。手足口相关病毒的2A蛋白酶和3C蛋白酶常用作做筛选靶点，2A和3C蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶，特异识别和切割蛋白质谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)之间的酰胺键。在病毒的生活史中主要参与干扰宿主蛋白合成、促进病毒蛋白原加工与成熟、协助病毒核酸复制以及启动宿主细胞程序性死亡等。总的来说，2A和3C蛋白酶在手足口病毒的生活史中具有重要作用，同时也是一个良好的研究靶点。但是目前尚没有针对该靶点的药物正式上市，这暗示了针对该靶点的药物筛选工作尚需要更新、更灵敏、更可靠的方法。现有的手足口病毒蛋白酶抑制剂筛选方法主要有酶偶联法、酵母双杂交法和HPLC测定产物法。其中，酶偶联法测定的精确度不高、线性范围较窄，可重复性不佳；而酵母双杂交法实验周期长，干扰因素较多；HPLC测定产物法周期比较长、通量小、针对仪器和操作人员的技术壁垒比较高。正是因为筛选方法的瓶颈，严重制约了基于此靶点药物的大规模、高通量筛选和发现。例如，辉瑞公司曾经采用酶偶联法筛选得到3C蛋白酶抑制剂芦平曲韦并进入开发阶段(Dragovichetal.,JMedChem,1999,42:1213–1224)，后因没有明显的临床药效宣告失败。总之，截止目前，尚没有基于此靶点的药物正式获批上市。因此，有必要建立快速、精确、干扰因素少的蛋白酶抑制剂筛选方法，从而推动蛋白酶抑制剂类的抗手足口药物大量涌现。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种抗手足口病药物活性检测方法及其试剂盒。该检测方法具有简单、微量、快速的优点，药物筛选工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于抗手足口病药物的筛选与开发；本法基于萤光素酶的生物发光检测方法，灵敏度高，干扰因素少，受试品兼容性强。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种抗手足口病药物活性检测方法，包括如下步骤：将编码Gln-Gly的核苷酸序列插入荧光素酶质粒，经体外非细胞转录翻译获得含Gln-Gly的重组荧光素酶；体外重组表达手足口病毒蛋白酶，手足口病毒蛋白酶为2A或3C蛋白酶；手足口病毒蛋白酶与含Gln-Gly的重组荧光素酶、受试物发生酶促反应，检测荧光素的生物发光强度，获得受试物的抗手足口病药物活性。本专利技术检测方法的基本原理为：荧光素酶质粒载入底物对应的核苷酸序列后，通过体外非细胞转录翻译系统合成重组萤光素酶。本专利技术中，2A和3C蛋白酶的底物为Gln-Gly二肽，对应的核苷酸序列可为CAAGGU。图1A示质粒中蛋白底物对应的核苷酸序列(CAAGGU)插入位点，质粒经体外非细胞转录翻译后合成重组萤光素酶。如图1B所示，萤光素酶由于多了Gln-Gly两个氨基酸残基，无法形成正确的催化构象，导致萤光素酶不能催化萤光素氧化发光；加入蛋白酶将萤光素中多余的氨基酸残基切开后，萤光素酶折叠形成正确的催化构象，催化萤光素氧化发光，因此，萤光素发光强度即表征了蛋白酶活力。以受试物对空白生物发光强度的抑制作用表征受试物的蛋白酶抑制力。在本专利技术提供的一些实施例中，手足口病毒选自柯萨奇病毒A2(CoxA2)、A4(CoxA4)、A5(CoxA5)、A7(CoxA7)、A9(CoxA9)、A10(CoxA10)、A16型(CoxA16)，柯萨奇病毒B1(CoxB1)、B2(CoxB2)、B3(CoxB3)、B4(CoxB4)和B5(CoxB5)型，肠道病毒71型(EV71)，以及埃可病毒(ECHO)。在本专利技术提供的一些实施例中，编码Gln-Gly的核苷酸序列为CAAGGU。根据密码子简并性，也可以使用其他可以翻译出Gln-Gly的其他核苷酸序列，如：CAAGGC，CAAGGA，CAAGGG，CAGGGU，CAGGGC，CAGGGA，CAGGGG。作为优选，荧光素酶质粒为pGloSensorTM-10F质粒。作为优选，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：1～10μg手足口病毒蛋白酶：10～100IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至10～200μL。优选地，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：1～10μg手足口病毒蛋白酶：10～100IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至100μL在本专利技术提供的一些实施例中，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：1μg手足口病毒蛋白酶：20IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至10μL在本专利技术提供的另一些实施例中，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：10μg手足口病毒蛋白酶：20IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至25μL在本专利技术提供的另一些实施例中，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：2μg手足口病毒蛋白酶：50IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至50μL在本专利技术提供的另一些实施例中，酶促反应的反应体系为：含Gln-Gly的重组荧光素酶：5μg手足口病毒蛋白酶：10IU受试物：＞0μmol/LHepes缓冲液：补足至150μL在本专利技术提供的另一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗手足口病药物活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码Gln‑Gly的核苷酸序列插入荧光素酶质粒，经体外非细胞转录翻译获得含Gln‑Gly的重组荧光素酶；体外重组表达手足口病毒蛋白酶，所述手足口病毒蛋白酶为2A或3C蛋白酶；所述手足口病毒蛋白酶与所述含Gln‑Gly的重组荧光素酶、受试物发生酶促反应，检测荧光素的生物发光强度，获得所述受试物的抗手足口病药物活性。

【技术特征摘要】
1.一种抗手足口病药物活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将编码Gln-Gly的核苷酸序列插入荧光素酶质粒，经体外非细胞转录翻译
获得含Gln-Gly的重组荧光素酶；
体外重组表达手足口病毒蛋白酶，所述手足口病毒蛋白酶为2A或3C蛋
白酶；
所述手足口病毒蛋白酶与所述含Gln-Gly的重组荧光素酶、受试物发生酶
促反应，检测荧光素的生物发光强度，获得所述受试物的抗手足口病药物活
性。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述手足口病毒选自
柯萨奇病毒A2、A4、A5、A7、A9、A10、A16型，柯萨奇病毒B1、B2、B3、
B4和B5型，肠道病毒71型，以及埃可病毒。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶促反应的反应
体系为：
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶促反应的温度
为30℃，时间为1～4h。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧伟，曹泽彧，丁玥，曹亮，李娜，丁岗，王振中，
申请(专利权)人：江苏康缘药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32