本发明专利技术公开了属于病毒检测技术领域的一种手足口病毒EV71核酸检测试剂盒。该试剂盒由N.BstNBI酶、T7RNA聚合酶、AMV反转录酶和RNase?H、NASBA反应液、NASBA反应引物、RIDA探针、DEPC水、甲型流感病毒HINI?RNA、乳癌细胞MCF-7总RNA和EV71RNA组成。本发明专利技术采用NASBA结合RIDA技术检测手足口病毒EV71核酸序列，具有灵敏，特异，简便，快捷，高效，不依赖特殊仪器等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒检测
，具体涉及ー种手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒。
技术介绍
手足ロ病是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、ロ腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。引发手足ロ病的肠道病毒有20多种，柯萨奇病毒A组的16、 4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足ロ病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见。手足ロ病毒感染的特异性诊断方法有三种，即病毒分离鉴定，血清学检测技术以及分子生物学技木。病毒的分离培养和血清学方法繁杂费吋，无法满足大量样本的快速诊断。近年来分子生物学技术尤其以核酸等温扩增技术为基础的检测技术发展迅猛。传统PCR包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光定量PCR技术在检测EV71病毒这类的RNA病毒吋，首先需要将其反转录成cDNA，一方面操作耗时，另一方面DNA容易造成交叉污染，引起后续试验的假阳性，此外传统PCR技术对仪器要求比较高，不易在基层医院进行推广。常用的核酸等温扩增技术有环介导等温扩增(LAMP)，序列依赖性等温扩增(NASBA)，核酸等温信号放大技术(RIDA)。NASBA，是由ー对引物介导的，连续均一的体外特异的对单链RNA进行恒温扩增的方法，可将模板RNA扩增约109-12倍。具有操作简便，灵敏度高，污染小等优点，不过传统的NASBA结果的判定易受温度，pH值等因素的影响。RIDA则是针对单链核酸标本利用特殊的探针收集荧光信号来判定是否存在目标序列的一种新的核酸等温扩增技木。这ー信号放大过程不存在扩增过程，因此不会有扩增产物的污染存在，特异性较高，但其灵敏度较低，检测极限仅为1012拷贝/ul。我们创新性的将两种检测方法結合，二者优势互补，扬长避短，可以快速，简便，灵敏，特异的实现对病原微生物的高通量检测及分型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒。ー种手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒，所述试剂盒由N. BstNBI酶、T7RNA聚合酶、AMV反转录酶和RNase H、NASBA反应液、NASBA反应引物、RIDA探针、DEPC水、甲型流感病毒HINI RNA、乳癌细胞MCF-7总RNA和EV71 RNA组成；所述NASBA反应液由dNTPs、NTP、ITP、RNasin、AMV 反转录酶 Buffer、T7 RNA 聚合酶 Buffer、RNase H Buffer、DMSO、山梨醇和NEB buffer组成；所述NASBA反应引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示；所述RIDA探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID N03所示。所述RIDA探针Y端标记荧光基团为FAM，3 ^端标记荧光猝灭基团为TAMARA。所述NEB buffer 为 NEB buffer 3 本专利技术的有益效果本试剂盒首次将NASBA与RIDA两种技术进行了优化组合，新技术的优势如下第一，单纯的扩增反应通过产生大量的核酸产物来实现对目标基因的检测，该模式容易产生污染，而新方法通过扩增结合信号放大的模式来实现对目标基因的检测，第一步扩增的过程可以控制在很短的时间内，使产物的量控制在一定范围之内，然后通过后续的信号放大系统来判定結果。由于NASBA扩增产物为RNA极易降解因而污染的可能性相对较小同时信号放大过程因为不存在扩增，所以不会产生污染。第二，通过在RIDA技术之前引入NASBA增强了 RIDA的灵敏度，同时两种方法的结合相对于单纯的扩增反应特异性有了很大提高， 即使第一歩出现非特异扩增也可以通过第二步信号放大加以纠正。再通过对反应时间的控制(減少第二步反应时间)可以使得第二步反应即使单独出现非特异也不会有信号显示从而也最大程度的降低了第二步反应出现非特异的可能性。由于两步同时出现非特异的可能性非常小，特别是由于第一歩扩增产物片段较小，针对扩增产物的信号放大几乎不可能出现非特异結果。所以这两种方法的结合是一种互补，既提高了灵敏度也增强了特异性。第三，整个反应可以只需ー个水浴锅和ー个简易荧光检测器即可实现对结果的判定，有利于在基层医疗检疫机构推广。综上所述，本试剂盒具有灵敏，特异，简便，快捷，高效，不依赖特殊仪器等优势，可以实现对手足ロ病毒EV71的筛选及快速诊断，便于在基层医院的推广。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进ー步说明。实施例I手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒的设计ー种手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒，采用如下实验设计而成(I)RNA提取取甲型流感病毒HINI培养液(阴性对照)1ml，乳癌细胞MCF-7培养液(阴性对照)1ml，手足ロ病病毒EV71培养液(阳性对照)1ml，DEPC水(空白对照)Iml ；RNA提取采用TAKARA病毒核酸提取专用试剂盒，提取方法參照说明书进行。提取到的核酸样本利用紫外分光光度计测量浓度，经过換算得到每微升拷贝数。(2)引物设计从Genebank下载核酸序列，选择肠道病毒EV71 5'端非编码区，设计合成NASBA引物，引物的Tm值一般比复性温度高7°C到10°C。设计的引物及序列如下Pl 5/ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCACCGGATGGCCAATCCA-3' (SEQ ID N01)；P2 5/ -GGTGTGAAGAGCCTATTGAG-3' (SEQ ID N02)；RIDA探针根据前ー步NASBA扩增后的靶序列设计，探针序列5' -AGGCGTGTGGAGTCCCTAACCGACTG-3' (SEQ ID N03) 5'端标记荧光基团为FAM (购自TAkARA公司)，3'端标记荧光猝灭基团为TAMARA(购自TAkARA公司)。探针序列下划线部分为切刻内切酶N. BstNBI对应的识别位点。引物由北京奥科生物公司合成。探针由TAKARA公司合成。(3)反应步骤在 15 μ L NASBA 混和物(包含 lmmol/L dNTPs, lmmol/L NTP,O.5mmol/L ITP，Pl 和 P2 引物各 O. 4 μ mol/L，6U RNasin,2. 5μ L AMV 反转录酶 Buffer (NEB公司)，2· 5 μ L Τ7 RNA 聚合酶 Buffer (NEB 公司)，I μ L RNase H Buffer (NEB 公司))中加入IuL模版(模版为甲型流感病毒HINI RNA，乳癌细胞MCF-7RNA，手足ロ病病毒EV71RNA或者DEPC水)，混匀后在水浴锅上65°C加热5min，然后在41°C温浴5min。温浴结束后向溶液中加入 O. 08 U RNase H, 32U T7RNA 聚合酶，4U AMV 反转录酶，I μ L DMSO,7. 5mmol 山梨醇，50pmol/L RIDA 探针，2 μ L NEB buffer3，5U N. BstNBI 酶(NEB 公司)。总反应体积达到20 μし在水浴锅上40°C反应90min后将温度调整为55°C，水浴加热lOmin。反应结束后取出反应管放置在紫外下观察颜色变化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种手足ロ病毒EV71核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由N. BstNBI酶、T7RNA聚合酶、AMV反转录酶和RNase H,NASBA反应液、NASBA反应引物、RIDA探针、空白对照、阴性对照和阳性对照组成；所述NASBA反应液由dNTPs、NTP、ITP、RNasin, AMV反转录酶 Buffer、T7RNA 聚合酶 Buffer、RNase H Buffer、DMSO、山梨醇和 NEB buffer 组成；所述NASBA反应引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示；所述RIDA...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐东刚，洪明，王圆圆，邢微微，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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