本发明专利技术公开了一种检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的引物及其方法，利用本发明专利技术引物及方法能够准确、快速检测出飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，将南方水稻黑条矮缩病毒与普通水稻黑条矮缩病毒准确的区分开来，特别是能准确地快速鉴定出单头白背飞虱体内是否携带南方水稻黑条矮缩病毒，可应用于病害诊断和预测预报上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属农业科学
，涉及ー种检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的PCR引物及其方法。
技术介绍
南方水稻黑条矮缩病是近年在我国南方稻区新发现的一种水稻病毒病，2008年由华南农大首次报道，2009年全国发生300万亩，2010年迅速上升至1900万亩，给水稻生产带来巨大损失。目前的研究结果表明白背飞風(SbgaieWa Λ/rci/era)是该病毒病的田间主要传播介体，因此白背飞虱的种群数量及其带毒率是预测预报南方水稻黑条矮缩病发生的重要指标。*单虫带毒检测的难点在于ー头飞虱的体积很小，病毒的含量非常少，从单头虫子体内提取病毒再用于检测非常困难。目前检测关于飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV)的检测技术主要分为血清学技术和分子检测技术两种。浙江大学江等研究単位利用单克隆抗体技术进行南方黑条矮缩病毒的检测，不过该项技术不能区分亲缘关系与之非常相近的普通水稻黑条矮缩病毒(riceblack streaked dwarf virus, RBSDV)。华南农大报道了用一步双重RT-PCR检测技术南方水稻黑条矮缩病毒的方法，该方法利用2对基因特异性引物进行反转录和扩增，但2对引物不仅增加了检测成本，而且出现一条扩增条带时无法准确判断到底是否带毒。因此有必要建立ー种能准确从单头白背飞虱体内检测南方水稻黑条矮缩病毒的技术。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供ー种检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的PCR引物及其方法，利用本专利技术所述引物及方法能够准确、快速检测出飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，将南方水稻黑条矮缩病毒与普通水稻黑条矮缩病毒准确的区分开来，特别是能准确地从单头白背飞虱体内检测南方水稻黑条矮缩病毒。本专利技术提供的技术方案是ー种检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的引物，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所示,反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。 同时，本专利技术还提供一种检测检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的方法，该方法是提取待测样品总RNA为模板，反转录获得cDNA ;以所述的cDNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，然后取扩增产物进行检测，若扩增产物大小约为338bp，则待测样品中存在南方水稻黑条矮缩病毒。上述的方法中，所述总RNA为模板反转录获得cDNA过程中，采用随机引物，所述的随机引物为6个碱基的随机引物，例如生エ生物工程上海有限公司产品编号为B0043的产品O本专利技术具有以下有益效果 与现有技术相比，本专利技术的优点是应用本专利技术的检测方法，仅用本专利技术的一对引物就可将南方水稻黑条矮缩病毒与普通水稻黑条矮缩病毒准确的区分开来，特别是能检测出单头飞虱体内的南方水稻黑条矮缩病毒，而且检测结果准确，灵敏度高。本专利技术方法使用随机引物进行反转录，转录产物的丰度大，使得条带更亮更清楚。本专利技术的引物和方法可应用在病害诊断和预测预报上，利用本专利技术方法可以排除水稻黑条矮缩病的干扰，快速鉴定出单头飞虱体内是否携帯南方水稻黑条矮缩病毒。附图说明图I是本专利技术引物扩增的琼脂糖凝胶电泳图，从左至右图中第一条泳带为Marker，第二泳道为SRBSDV阳性对照，第三泳道为RBSDV，其余为检测的单虫。具体实施方式 下面通过具体实施方式的详细描述来进ー步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限制，仅仅作示例说明。一、引物的设计 本专利技术人利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI捜索并下载南方水稻黑条矮缩病毒S5序列，运用DNAssist软件对这些序列进行比对，找出不同研究者报告的南方水稻黑条矮缩病毒核苷酸序列所共有而其它病毒序列均与之不同的引物候选区，设计出一对特异性引物，引物序列如下 正向引物5’ -TACGCAATACCTCATACCTG-3，(SEQ ID No. I), 反向引物5’-AAGACTTGTTTCTGCTGGTT-3’ ( SEQ ID No. 2)。上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成，预期的PCR产物为338bp。ニ、病毒的RT-PCR过程 (一)提取总RNA，方法如下 1.取单头虫子于离心管中，液氮研磨； 2.加入100μ L的Trizol试剂； 3.加入500mL氯仿-异戊醇(24:1)剧烈震荡摇匀15s; 4.冰浴IOmin,12000r/min离心15min,取上清液于另一新离心管中； 5.加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)轻微混匀，取上清液于另一新离心管中； 6.加入IOOPL的异丙醇，颠倒混匀； 7.室温放置IOmin,12000r/min离心IOmin,弃上清； 8.加80%的こ醇洗漆沉淀,7500r/min离心5min,弃上清； 9.加无水こ醇洗漆沉淀，7500r/min离心5min,弃上清； 10.室温下沉淀并充分干燥后；溶于1(^LDEPC水中。(ニ)用上述设计的弓I物对提取的总RNA进行RT-PCR扩增 在O. 2 mL PCR反应管中加入如下试剂进行反转录模板RNA 3μ ，5倍第一链合成缓冲液4PL，dNTPs( 10mM)2PL，随机引物(生エ生物工程上海有限公司产品编号为B0043的产品，例如批次Lot ID 11-25) (25μΜ)0. 8μ ，无RNA酶的无菌水9. 2μ ，混匀后65°C预变性5 min，迅速置于冰上；然后加入M-MLV反转录酶(200U/>L) μ ,42で水浴反应I h，4°C保存备用。PCR扩增反应体系25μ ，其中，模板cDNA 2μ , 10XPCR Buffer 2. 5 μ L，dNTPs(IOmM) O. 5μ L, F 端引物(SEQ ID No. I) (10 μ Μ) μ ，R 端引物(SEQ ID No. 2) (ΙΟμΜ)lKL，灭菌去离子水17. 5 μ L，TaqDNA聚合酶(2. 5U/μ L) O. 5 μしPCR的反应条件为95°C预变性5min，95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸45s，35个循环，72°C延伸IOmin。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，若扩增产物大小约为338bp，则待测样品中存在南方水稻黑条矮缩病毒。 用上述方法对湖南省2011年田间采集的白背飞虱进行了检测，部分结果请參见图1，扩增出338bp的条带，与预期的一致。说明了本专利技术能准确区分南方黑条矮缩病毒和普通黑条矮缩病毒，且检测条带清楚。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的引物，其特征在于其正向引物核苷酸序列如SEQ ID No. I所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。2.一种检测检测飞虱体内南方水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于提取待测样品总RNA为模板，反转录获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：周倩，高必达，朱俊子，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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