Ｃ型肝炎病毒抗体制造技术

本发明专利技术系关于与Ｃ型肝炎病毒Ｅ２蛋白结合之人源化抗体及其片段，及其使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术系关于保持亲本鼠单克隆抗体之对HCV感染的广谱抑制作用的治疗性人 源化抗体及其片段，及其使用方法。
技术介绍
HCV为属于黄病毒家族之正链RNA病毒。其为非A非B病毒性肝炎之主要原因。 HCV已感染约200，000, 000人且目前之估算表明每年新感染多达3，000, 000个体。约80% 彼等感染者未能清除病毒；接着发生慢性感染，此通常导致严重慢性肝病、硬化及肝细胞 癌。慢性感染的当前治疗效率低且急迫需要开发预防性及治疗性疫苗。由于RNA依赖性RNA聚合酶之易出错特性及活体内高复制速率，因此HCV展示高 度遗传可变性。HCV可分为6种独特遗传基因型且进一步细分为至少70种亚型，其核苷酸 水平分别相异约30%及15%。疫苗研发之主要挑战将为识别在多数病毒基因型及亚型中 保守之保护性表位。此问题因包膜蛋白(中和反应之天然标靶)为两种最可变蛋白质之事 实而变得复杂。包膜蛋白El及E2负责细胞结合及进入。其为具有N末端胞外域及C末端疏水性 膜锚着点的N连接之糖基化跨膜蛋白。活体外表达实验已展示El及E2蛋白形成提议为病 毒表面之功能错合物的非共价杂二聚体。由于缺乏有效培养系统，因此病毒进入之确切机 制未知。尽管如此，仍有增长之证据表明进入经分离原代肝细胞及细胞系需要与细胞表面 受体CD81及B类1型清道夫受体(SR-Bl)之相互作用，尽管单独之此等受体不足以允许病 毒进入。当前证据表明细胞介导之免疫在急性感染中病毒复制之清除及控制中至关重要。 然而，代用感染模型(诸如，动物感染及细胞及受体结合检定)已强调抗体在急性及慢性感 染中之潜在作用。不令人吃惊地，中和抗体辨识线性及构形表位两者。多数表明广泛中和 能力之抗体系针对E2内之构形表位。辨识保守构形表位之抗体的诱导与疫苗设计关系极 大，但此可能证实难以实现，因为可变区看似为免疫显性的。一种此类免疫显性线性表位位 于E2之第一高变区(HVRl)内。已提议使用保守HVRl模拟表位克服受限特异性之问题，但 仍未知此方法是否将成功。HVRl之直接下游区域含有多个表位。一个包括残基412-423且由单克隆抗体AP33 定义之表位抑制⑶81与一系列表达形式之E2 (包括可溶性E2、E1E2及病毒样颗粒)之间 的相互作用。参见 Owsianka A.等人，J Gen Virol82 1877-83 (2001)。WO 2006/100449教示命名为AP33之单克隆抗体可结合且中和HCV之6种已知基 因型1-6中之每一者。因此，推断AP33靶向之表位与HCV之所有基因型1_6交叉反应，表4明其为抗HCV配位体之标靶且为产生抗HCV抗体之免疫原。AP33为小鼠抗体，且因此若治疗学上用于多次投与，则可能在人类患者体内产生 人类抗小鼠抗原性反应(HAMA)。因此需要与AP33共享交叉反应性但在人类个体体内具有 降低之抗原性的抗体。
技术实现思路
本专利技术系关于改良之治疗性人源化抗体，其保留对HCV感染之广泛范围的抑制作 用。已展示技术上未解决AP33之人源化，且人源化AP33之产生已导致以下研究。在AP33单克隆抗体之人源化期间，本专利技术者遭遇与人源化可变轻链域之不良表 达水平有关的问题。不存在小鼠轻链的人类直系同源物。Ll环不可与人类κ链匹配且此 人类κ链通常为人源化过程之关键组份。尽管已对可变轻链域作出若干修饰(诸如移除 潜在剪接位点突变及交换前导序列)，但此等修饰均不会将表达水平有效恢复至高于背景， 尽管先前已报导该等修饰有效改良表达水平。令人惊奇地，本专利技术者最终识别出可变轻链 域(在本文中命名为RK2b)，其不仅表达良好且具有良好轻链接合活性。本专利技术者亦已发现人源化可变重链域之最佳活性需要位置47处之W的保留。此令 人惊奇，因为在小鼠(嵌合)抗体中，位置47处之氨基酸为W (人类残基)或Y(小鼠残基) 看似不重要。在人源化可变重链域中，位置47处之氨基酸对于最佳活性而言应为W。正相 反，所有其它重要框架残基(亦即，微调残基(vernier residue)及规范残基(canonical residue))对于最佳活性而言需要突变为小鼠供体残基。本专利技术者此外惊奇地发现本文所述之人源化抗体在抑制HCV感染时至少与AP33 一样有效。一般而言，当抗体人源化时，由于以人类框架置换形成围绕CDR之环境的鼠框 架，因此预期活性会降低。然而，在本专利技术中，置换鼠框架已导致活性增加。有利地，本专利技术 之抗体不仅具有与人源化有关之优势(例如，使其在人类个体体内具有较低免疫原性)，而 且亦保留广泛范围之针对HCV种的中和交叉反应性。因此在第一方面中，提供人源化AP33抗体之可变轻链域，其包含或由SEQ ID NO 6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 19或SEQ ID NO 20中之任一者所述的氨基酸序列组成。在 一些实施例中，人源化AP33抗体之可变轻链域与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在第二方面中，提供人源化AP33抗体之可变重链域，其包含或由SEQID No. 3中所 述之氨基酸组成。SEQ ID No. 3表示移植到人类框架上之鼠CDR。有利地，人类框架藉由在 其位置30、48、67、71、78及94中之一或多者处回复突变来修饰，从而匹配小鼠染色体组中 之等效位置。合适地，氨基酸突变为取代，例如S30T、I48M、V67I、V71R、F78Y及R94L。在上文 中，其次表示小鼠残基且首先表示人类残基；因此，在人源化程序中，残基30在初始AP33框 架中为T，在所采用之人类框架中为S，且在回复突变、人源化抗体框架中为T。在一些实施例中，可变重链域包含或由SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ IDNO : 16、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO 18中之任一者所述之氨基酸序列组成。在一些实施例中，人源化AP33抗体之可变重链 域与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在第三方面中，提供包含本专利技术第一方面所述之可变轻链域的人源化抗体或人源化抗体片段。在一些实施例中，包含可变轻链域之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝 炎病毒E2蛋白结合。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。在第四方面中，提供包含本专利技术第二方面之可变重链域的人源化抗体或人源化抗 体片段。在一些实施例中，包含可变重链域之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝炎病 毒E2蛋白结合。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。在第五方面中，提供包含轻链及重链之人源化抗体或人源化抗体片段，其中轻链 可变区及重链可变区系如上文之第一及第二方面中所定义。在一些实施例中，包含轻链可 变区及重链可变区之人源化抗体或人源化抗体片段与C型肝炎病毒E2蛋白结合。在一些 实施例中，其人源化抗体片段系选自由Fab片段、Fab'片段、F(ab' )2片段、scFV、FV及双 功能抗体组成之群。在一些实施例中，人源化抗体片段为抗原结合片段。在第六方面中，提供编码可变轻链域之核酸序列。合适地，编码可变轻链域之核酸序列包含或由SEQ ID NO :26、SEQ IDNO :27、SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
与Ｃ型肝炎病毒Ｅ２蛋白结合之人源化抗体或其抗原结合片段，其中该人源化抗体或其抗原结合片段包含选自由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１５、ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１６、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７及ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８组成之群的可变重链域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴维J马修斯，戴维G威廉斯，阿尔文德帕特尔，
申请(专利权)人：医疗技术研究局，
类型：发明
国别省市：GB[英国]