一种肠道病毒７１型全基因组序列，其特征在于，所述序列具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肠道病毒，更具体的涉及肠道病毒71型基因组的序 列及其应用。
技术介绍
2008年全国大面积爆发了儿童手足口病。引起此次手足口病的 罪魁祸首就是人肠道病毒71型(EV71)。截止到2008年12月16曰， NCBI公布的EV71相关序列为2145个，但其中并没有EV71病毒全 基因序列，因此无法得到全面资料以准确判断全球以及我国人肠道病 毒71型的流行和遗传变异情况，进而无法了解目前全球手足口病的 流行和遗传衍化情况。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于提供一种EV71病毒的全基因序列。为解决上述问题，本专利技术一方面提供了一种肠道病毒71型全基 因组序列，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。本专利技术另 一方面提供了所述序列及与所述序列同源性达50-95% 的序列在制备用于预防肠道病毒71型疫苗和血清学诊断ELISA试剂 中的用途。本专利技术另 一方面提供了所述序列及与所述序列同源性达50-95% 的序列在制备抗肠道病毒71型中和抗体中的用途。本专利技术的有益效果在于该序列为进一步获得我国华南地区EV71 型遗传衍化特征提供了客观依据，为进一 步研制开发针对我国不同地 区发病A^的血清学ELISA诊断试剂和疫苗提供了可靠的数据资料， 为深入研究EV71的遗传变异规律及手足口病的致病机制提供了宝贵 资源。附图说明图1是用megalign中的聚类clusterW进行一个聚类后，获得的 比对结果。图2是EV71 VP1区进化树分析结果。具体实施例方式病毒基因组核酸的提取和测序1. 采集标本采集深圳市东湖医院收治的手足口病人的病毒分 离标本，包括粪便、疱渗液、脑脊液和咽拭子，用于采集咽拭子的无 菌拭子要;^文在适当的保存液中，如维持液或生理盐水，以防干燥。2. 标本处理2.1粪便标本的处理2.1.1每管中加入10mlPBS、 lg玻璃珠和lml氯仿;2丄2在生物安全拒中从每份粪便标本中取大约2 g加入到标记好的离心管中；2丄3将剩余的原始标本留在原容器中并在-20。C冻存；2丄4拧紧离心管，机械震荡器剧烈震荡20分钟；2.1.5盖好离心机的盖子，密封离心桶，冷冻离心机在1500g离心20分钟；2丄6在生物安全拒中将每一份标本的上清液分别吸入2个有外 螺旋盖的冻存管中；2丄7 —管粪便悬液冻存于-20。C作为备份，另一管存于4-8。C以 备接种。2.2疱渗液标本的处理疱渗液标本直接用于病毒分离。2.3脑脊液标本的处理脑脊液标本直接用于病毒分离。2.4咽拭子标本的处理在标本保存液中充分搅动咽拭子(至少40下)，以洗下拭子上粘附 的病毒及含有病毒的细胞，然后在4。C条件下，10000rpm离心20分 钟，用上清接种到细胞上，如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。3. 分离病毒3.1显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的， 一个健康的4单层细胞会在传代后3天左右形成；3.2倒掉生长液(GM)，换上1-1.2 ml的维持液(MM);3.3每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管(包括标本的编号、日期、传代数)； 3.4每一种细胞至少标记一管作为阴性对照； 3.5每支试管接种0.2ml的标本悬液，34-35。C温度培养； 3.6每天使用倒置显微镜观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现(如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等)；3.7记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录 CPE(l+-4+)、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化 (l+， <25%; 2+, 25%國50%; 3+， 50%-75%; 4+， 75%-100%);3.8如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直 到75。/。的细胞发生变化(3+CPE)，然后储藏在-20。C以备二次传代。同 一病例的二次传代的病毒分离物可以放到 一起用于进一步的鉴定；3.9第l代培养见可疑细胞病变时继续传代，待细胞病变稳定出 现后-2(TC或-7(TC冻存；3.10 —代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将 病毒保存在-20。C冰箱(二代病毒)。因第二代病毒滴度高于第一代病 毒，所以选用第二代病毒进行鉴定。3.11如果7天之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7天。 盲传2代后，仍然没有出现CPE，则判定为阴性；如果接种后24小 时内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。4.提取病毒核酸可使用商业化试剂盒来提取RNA，例如使用QIAGENViral RNA Mini Extraction Kit(QIAGEN公司)从临床标本或病毒分离培养物中提 取病毒RNA:4.1向一支1.5 ml离心管中加入560 pi的AVL緩冲液(含Carrier RNA);4.2再向这支离心管中加入140 ^临床标本或病毒分离培养物， 充分混勻至少15秒；4.3室温下(15。C-25。C)放置IO分钟，瞬时离心；4.4加入560 pi纯乙醇，充分混匀至少15秒，瞬时离心； 4.5小心加入约630 [xl的混合溶液至QIAamp柱中，将QIAamp 柱套在收集管上，然后8000rpm离心5秒，使液体通过滤膜； 4.6弃去收集管中的液体，重复步骤4.6;4.7弃去收集管中的液体，小心加入750 pl的AW1緩冲液至 QIAamp柱中，8000 rpm离心5秒，使液体通过滤膜；4.8弃去收集管中的液体，小心加入750 pi的AW2緩冲液至 QIAamp柱中，8000 rpm离心5秒，使液体通过滤膜；4.9弃去收集管中的液体，13000 rpm再次离心1分钟；4.10将QIAamp柱放入一支干净的1.5 ml的离心管中；4.11向膜上加入40)il的EB緩冲液，然后室温静置2-5分钟；4.12 8000 rpm离心1分钟，离心下来的液体即为所需的核酸溶液；4.13RNA的检测4.13.1将制胶用具以及电泳槽用水沖洗干净后，使用3%过氧化 氢室温浸泡15分钟，最后使用lxTBE沖洗2-3次，再加入lxTBE 电泳緩沖液。4.13.2将1.20/o琼脂糖凝胶方tA水平电泳槽中，将RNA样品(2-5 pl)和等体积的2xGel loading buffer Ambion混合均匀，加到凝胶点样 孔中，电泳。4.13.3将胶在EB溶液中染色IO分钟，紫外灯检测。4.13.4 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent公司)检测RNA浓度和质5基因组测序5.1反转录第一链的合成5.1 1在200 pl的PCR管中加入以下试剂(试剂盒购自invitrogen 公司)mRNA l(M N6引物(lug/ pl)或oligo(dT) 18-20 (500ug/ pl) 1 dNTPmix(10mM) 2 pL5丄2在PCR仪上65。C变性5分钟后，立即将EP管置于冰上， 离心。5.1.3按照下列的配比准备反应混合物， 5 x 1 st strand buffer 4lOOmMDTT 1 RNAseOUT (40U小L)1 |iL5.1.4将步骤5.1.3中的6 pl混合物加入步骤1中的EP管中，混 匀后如果是N6引物则逆转录室温(25-C)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒７１型全基因组序列，其特征在于，所述序列具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周伯平，杨桂林，刘威龙，陈心春，张明霞，刘映霞，徐六妹，
申请(专利权)人：深圳市第三人民医院，
类型：发明
国别省市：94
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