高通量多位点人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及法医学、刑侦及物证鉴定等领域，具体涉及一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用，该检测试剂盒，包含由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠，该试剂盒具有高分辨度、高准确性和高通量的特点。

【技术实现步骤摘要】
高通量多位点人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用
本专利技术涉及法医学、刑侦及物证鉴定等领域，具体涉及一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒及其制备和应用，所述试剂盒具有高分辨度、高准确性和高通量的特点。
技术介绍
在法医、刑侦及物证鉴定等工作中如何追踪、认定嫌疑人；在犯罪、灾害等事件中如何判定相关人员或遇难者；在亲属认定中如何确定亲缘关系等等是人类文明史中早就出现并不断探索的目标。当100多年前遗传学由于孟德尔(G.J.Mendel)的奠基性工作而成为一门学科以后，随着遗传学的每一个进展都使上述的工作有了更坚实的科学基础。1985年英国遗传学家杰弗瑞斯(A.Jeffreys)首次提出所谓“DNA指纹”，指出在人类基因组中的某些区域具有重复序列，而且这类重复序列有个体差异(多态性)并能够遗传。使用DNA来行使个体鉴定有许多优点：(1)DNA作为遗传信号的载体存在个体差异，表现为形状上的差异；(2)DNA作为遗传的载体又是稳定的、与亲缘关系的基础；(3)人体上任何有核的细胞都可以作为DNA分析的对象；(4)DNA样品的稳定性较好。最早用于检测遗传多态性的方法是使用限制性内切酶对人类基因组中可变数目串联重复(VNTR)做限制性片段长度多态性分析(RFLP)，但是这个方法的缺点在于需要较为完整(分解的程度较低)并较为大量的样品，这对法医现场来说有时无法实现，同时，该方法的分辨度也较低。随着技术的发展，DNA聚合酶链式反应(PCR)的出现使对样品量的需求大大降低，将分析目标集中到VNTR中的短片段串联重复(STR)序列，又使得较短的核酸片段也能够用于分析，加上多重PCR技术的应用，迅速使STR基因座的分型检测在法医和刑侦中迅速推广，并使收集相关人群STR分析结果的数据库日益扩大。上述基因组中同一位点上的多态性表现为在这一位点上有两个或多个不同的核酸一级结构(核苷酸的种类或重复序列的个数等)，被称为等位基因，分析等位基因的结构被称为基因分型。等位基因越多基因型就会越多，如等位基因的数目为n，就意味着有n种纯合子和n(n-1)/2种杂合子。例如在某一位点上有10个等位基因，就应该存在10种纯合子和45种杂合子，即在这一位点上存在55种等位基因。在个体鉴定中需要同时检测多个位点(基因座)上的多态性，如果它们都是不连锁的，其基因座的频率可以相乘，如果提高基因座的数目就有可能大大提高个体鉴定的可信度。上世纪90年代以来对STR通用的检测方法是以多重PCR检测约20个基因座的基因型，在检测中使用以荧光标记的引物并设计好扩增子的长度，使所产生的不同长短的具有荧光标记的针对每个基因座的扩增子在毛细管电泳中分离，并与标准物进行比对，从而实现对每个基因座中的等位基因进行分型。但是，这种方法也存在着由于技术上的限制而带来的缺陷，主要有：(1)由于荧光标记物的相互干扰和毛细管长度及成像技术等方面的限制，被分析基因座的数目已难以进一步大幅提升；(2)由于分析的对象是各个片段的长度大小，无法进一步检测到组成片段的核酸一级结构的微小差异，因此限制了检测的分辨度；(3)出峰宽度受电泳条件影响，导致碱基个数相差1-2bp时难易分辨；(4)Stutter峰(片段分析中时而出现于主峰前的小峰)的干扰，尤其是存在混合样品时。高通量测序法可以弥补以上缺陷，(1)检测位点数几乎不受平台限制；(2)核心重复数一致的情况下，测定出的序列微变异可以进一步区分不同个体，提高检测的分辨度；(3)序列信息直接反映核心重复数，更加准确。但同时高通量测序具有成本高，操作复杂的缺陷，只有提高样本检测通量至几百人份，并简化操作流程至1个工作日内，才有可能使该技术真正应用于STR的实际检测。各测序公司已经开展应用高通量测序法平台测定人类STR基因座的研究工作，包括罗氏的GSFLX、Illumina的GAIIx和LifeTechnology的PGM平台。现有研究成果的单次测序只达到5-10人份的10-13个STR的检测通量，并且需要进行DNA提取、单重PCR、单重PCR产物混合、连接建库等复杂操作，均未形成基于高通量测序方法的，可以真正用于STR实际检测中的商业化试剂盒。CN201210466090.4公开了高通量DNA测序法用于测定人类基因组中短片段串联重复基因座的方法及试剂盒，包括10组含有不同样本标签的融合引物池，每组融合引物池含有16对带有相同样本标签的融合引物，采用高通量测序法对10份样品共计16个位点进行分型。但由于现有STR商业检测试剂盒的常见检测位点约20个，CN201210466090.4未充分考虑位点选择和现有STR试剂盒的兼容性，以及样本数和位点数的平衡性关系，会影响比对的有效性，尤其是公安的个体识别。同时，由于样本数和位点数的增加，使得所需样本标签和引物对数大大增加，能否既保证其有效性，又实现每个位点对应目的序列的扩增均衡性，是高通量测序通量固定的前提下，满足多样本、多位点同时检测的关键。此外由于接头和样本标签的引入，融合引物相比普通引物长度增加30-40个碱基。CN201210466090.4未充分考虑融合引物增长导致的引物二聚体去除困难问题。本专利技术申请采用高选择性DNA纯化磁珠，并优化DNA纯化的操作流程，能够有效去除<60bpDNA片段并保留>80bpDNA片段，从而保证后期高通量测序结果的有效性。
技术实现思路
本专利技术通过试剂盒组分和操作流程的设计和改良，形成全套的适用于高通量DNA测序平台，可实现多样本、多个STR基因座平行、稳定测试的试剂盒。本试剂盒分辨度达到核苷酸水平，免DNA提取，单次测定可在一个工作日内完成，一次测定实现几百人份的几十个STR基因座检测，测定成本和操作时间容许大批量的DNA数据库构建使用。本专利技术具体技术方案如下：第一方面，本专利技术涉及一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒，包含由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠。第二方面，本专利技术涉及由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池在制备用于检测人类短片段串联重复序列的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒还包括免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠。在本专利技术的优选实施方案中，所述多重PCR引物是融合引物，其包含目的片段特异性引物、测序接头、固定接头、样本标签，其中目的片段特异引物用于扩增含有STR核心重复区的目的片段，固定接头用于绑定捕获磁珠，测序接头用于以通用引物测序，样本标签用于区分不同样本。在本专利技术的另一优选实施方案中，所述目的片段特异性引物特异性针对一或多个STR基因座，优选针对至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少50个或更多个STR基因座，更优选针对表2中的24个STR基因座，优选所述样本包括至少100份，更优选至少200份，更优选至少500份，更优选至少1000份或更多，最优选192份。。在本专利技术的另一优选实施方案中，所述PCR反应缓冲液包含Tris-HCl、Mg2+、(NH4)2SO4，优选Tris-HCl为20mM，Mg2+为50mM。在本专利技术的另一优选实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒，包含由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种人类短片段串联重复序列检测试剂盒，包含由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池、免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠。2.由不同样本标签标记的人类短片段串联重复序列特异性的多重PCR引物池在制备用于检测人类短片段串联重复序列的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒还包括免DNA提取PCR扩增酶、PCR反应缓冲液以及任选的对照DNA、DNA纯化磁珠。3.权利要求1的试剂盒或权利要求2的用途，其中所述多重PCR引物是融合引物，其包含目的片段特异性引物、测序接头、固定接头、样本标签，其中目的片段特异引物用于扩增含有STR核心重复区的目的片段，固定接头用于绑定捕获磁珠，测序接头用于以通用引物测序，样本标签用于区分不同样本。4.权利要求3的试剂盒或权利要求2的用途，其中所述目的片段特异性引物特异性针对一或多个STR基因座，优选针对至少10个、或至少15个、或至少20个、或至少50个或更多个STR基因座，更优选针对表2中的24个STR基因座，优选所述样本包括至少100份，更优选至少200份，更优选至少500份，更优选至少1000份或更多，最优选192份。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：周骋，潘雅姣，曲保旺，
申请(专利权)人：北京爱普益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11