本发明专利技术提供一种欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，该方法是针对ＰＲＲＳＶ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ７基因中欧、美型毒株的保守表位２５ａａ～３０ａａ，３７ａａ～５２ａａ及５０ａａ～６６ａａ的基因缺失，构建针对美洲型ＰＲＲＳＶＮ蛋白的原核表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１－Ｎ；针对欧洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白表位２ａａ～１２ａａ、４０ａａ～４６ａａ及６７ａａ～１２８ａａ的氨基酸序列，建立针对欧洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白的原核重组表达载体ＰＱＥ３０－Ｎ，重组质粒在大肠杆菌中成功表达，利用表达纯化的北美洲型Ｎ蛋白，制备用于ＰＲＲＳ抗体检测的间接ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒，该抗体试剂盒与ＩＤＥＸＸ试剂盒的符合率均可达到９０％，以纯化的欧洲型蛋白作为包被抗原，优化了欧洲型ＰＲＲＳＶ抗体检测间接ＥＬＩＳＡ方法，为ＰＲＲＳ抗体分型检测打下基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
内的兽病诊断技术，具体是一种欧、美型猪繁殖 与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法。2、
技术介绍
PRRS的发生和流行，已给我国的养猪业造成了相当大的经济损失。但是目 前，对该病的预防与控制仍是世界各国所面临的难题。为了更好地预防和控制 本病的发生和流行，当务之急是要建立一种可靠的、适于大规模诊断与检测PRRS 的方法。PRRS感染常用的诊断方法有细胞培养、RT-PCR。但是，这些诊断方法 在应用中耗时长、工作量大、需要特殊的仪器和设备，远远不能满足当前诊断 PRRS感染的需要，尤其不适合大规模的临床样本检测与开展流行病学调査。PRRSV分为美洲型与欧洲型两种基因型，欧洲地区主要流行欧洲型，而美洲 及亚太地区则以美洲型为主。目前，我国所分离获得的毒株大多数属于美洲型， 赵耘等通过分子生物学及血清学方法鉴定了一株欧洲型PRRSV，预示现在我国猪 群中可能同时存在欧、美型PRRSV。 二者的0RF7编码的病毒结构蛋白都具有良 好的抗原性，且N蛋白核苷酸序列型内保守，型间差异较大。因此，本研究在N 蛋白的基础上剔除了欧、美型PRRSV型间保守的抗原表位，利用原核表达的融 合蛋白作为抗原，建立一种适用于大规模检测PRRS抗体的间接ELISA方法，首 次在国内人工合成了欧洲型PRRSV N蛋白型特异性抗原表位，建立了检测欧洲 型PRRSV抗体的ELISA方法；以期为我国PRRS的诊断与检测和血清学调査提供 快捷的技术手段。3、
技术实现思路
本专利技术的目的是研制一种能够区分欧、美洲型的PRRS抗体检测试剂盒，最 终为大规模的临床样本检测与开展流行病学调査提供一种有效的试剂盒。 本专利技术专利是通过以下技术方案实现的 1)目的蛋白的表达及纯化PRRSV VR-2332的0RF7基因中欧、美型毒株的保守表位25 aa 30 aa， 37 aa 52 aa及50 aa 66 aa的基因缺失，构建了针对美洲型PRRSV N蛋白的原 核表达载体pGEX-6P-1-N;针对欧洲型PRRSVN蛋白表位2aa 12aa、 40 aa 46 aa及67 aa 128 aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N蛋白的原核重 组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。 2)欧、美型PRRSV抗体检测间接ELISA方法的建立利用纯化的美洲型及欧洲型PRRSV N蛋白分别建立间接ELISA方法，确定 了美洲型N蛋白抗原包被浓度为4. 5 u g/mL，欧洲型N蛋白抗原包被浓度为8 p g/mL;抗原包被条件均为37。C 1 h加4。C包被过夜；血清的稀释度均为1:40， 30min作为美洲型N蛋白包被时血清的最适工作时间，60min作为欧洲型N蛋白 包被时血清的最适工作时间；均使用P/。的BSA封闭，服P-兔抗猪IgG的使用浓 度均为1:1000，结合时间均为30min;美洲型N蛋白包被时，样本0D450 43， 判定为阳性；0D450值〈0.43的判定为阴性;欧洲型N蛋白包被时，样本OD450 》0.40，判定为阳性；0D450值< 0.40的判定为阴性。不论何种抗原包被，对 猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小病毒病阳性血清的0D450值均小于0.40， 均为阴性，表明该重组蛋白抗原与猪瘟、伪狂犬病、猪乙型脑炎、猪细小的阳 性血清没有交叉反应，说明ELISA方法具有良好的特异性，均可以用于PRRS抗 体的检测。欧洲型PRRSV阳性血清与美洲型N蛋白包被板发生交叉反应，美洲型PRRSV 阳性血清与欧洲型N蛋白包被板也发生交叉反应，两者OD450值均略高于阴阳 性临界值，但都远低于同型血清与同型抗原的反应值，表明所建立的针对欧洲 型及美洲型PRRSV的间接ELISA方法可区分欧洲型及美洲型毒株的感染，但需 进一步优化待检血清稀释度，使交叉反应的0D450均低于阴阳性临界值。本专利技术的方发所具有的积极效果是，由于国内目前为止尚未发现欧洲型 PRRSV感染，获得的欧洲型PRRSV阳性血清的量有限，交叉反应问题暂时还未得 到解决。检测欧洲型PRRSV感染的ELISA检测方法的建立为猪病检测提供了技 术储备。 附图说明附图1是重组蛋白GST-N的纯化产物；图中l:为全分子量蛋白质标准；2:为包涵体溶解后的上清；3 5:为过柱 纯化后的蛋白。附图2是重组蛋白HIS-N的纯化产物；图中1低分子量蛋白Marker, 2 5分别为亲和层析纯化收集第4管、第3 管、第2管、第1管蛋白。附图3是重组蛋白GST-N的Western-Blot分析； 图中1 3泳道均为纯化后GST-N融合蛋白。附图4是HIS-N融合蛋白Western-Blot分析。 图中1 2泳道均为纯化后HIS-N融合蛋白。 附图5是重组美洲型PRRSV N蛋白的薄层凝胶扫描分析曲线； 附图6是重组欧洲型PRRSV N蛋白的薄层凝胶扫描分析曲线。 具体实施方式1) 目的蛋白的表达及纯化针对PRRSV VR-2332的0RF7基因中欧、美型毒株的保守表位25 aa 30 aa， 37 aa 52 aa及50 aa 66 aa的基因缺失，构建针对美洲型PRRSV N蛋白的原 核表达载体pGEX-6P-1-N;设计并合成针对欧洲型PRRSV N蛋白表位2 aa 12 aa、 40 aa 46 aa及67 aa 128 aa的核酸序列，建立了针对欧洲型PRRSV N 蛋白的原核重组表达载体PQE30-N，利用纯化试剂盒进行蛋白纯化。复性后的重组蛋白GST-N，经还原型谷胱甘肽洗脱，得到目的蛋白(如图1所 示)。亲和层析纯化后目的蛋白纯度达到90%以上。重组融合蛋白HIS-N经镍亲 和层析柱纯化后，存在极少量的杂蛋白，其纯度可达95%以上，纯化效果达到 预期目的(如图2所示)。1. 1重组蛋白的Western-Blot分析分别用猪PRRSV美洲型与欧洲型阳性血清对纯化后基因工程重组菌表所表 达的蛋白进行Western-Blot分析。结果显不GST-N在大约32. lKDa处出现一条 清晰的棕褐色印迹(见图3) 。 HIS-N在大约10. 5KDa处也有一条清晰印迹(如图4 所示)。表明重组蛋白均可被PRRSV阳性血清所识别，且具有良好反应原性。将电泳后的SDS-PAGE凝胶进行薄层扫描，结果显示pGEX-6P-1-N表达的重 组融合蛋白量占菌休总蛋白的47. 8%， PQE30-N表达的重组融合蛋白量占菌体总 蛋白的46.5% (如图5、 6所示)。2) 重组蛋白抗原最适包被浓度和待检血清稀释浓度的确定 用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原GST-N分别作18u g/ml、9u g/ml、4. 5u g/ml、 2. 25 n g/ml、 1. 125 u g/ml、 0. 56 " g/m 0. 30 u g/ml 0. 15 " g/ml 8个 倍比稀释度，包被酶标反应板，4。C过夜。用包被液将提纯得到的重组蛋白抗原 HIS—N分别作32u g/ml、 16 u g/ml、 8ug/ml、 4ug/ml、 2ug/ml、 1 ii g/m 0.5 Ug/ml 0. 25 u g/ml 8个倍比稀释度，包被酶标反应板，4。C过夜。用血清稀释 液将PR本文档来自技高网...
【技术保护点】
欧、美型猪繁殖与综合症病毒抗体鉴别诊断试剂盒的制备方法，其特征在于，制备步骤如下： １）目的蛋白的表达及纯化： 针对ＰＲＲＳＶ ＶＲ－２３３２的ＯＲＦ７基因中欧、美型毒株的保守表位２５ａａ～３０ａａ，３７ａａ～５２ａａ及５０ａａ～６６ａａ的基因缺失，构建针对美洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白的原核表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１－Ｎ；针对欧洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白表位２ａａ～１２ａａ、４０ａａ～４６ａａ及６７ａａ～１２８ａａ的核酸序列，建立针对欧洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白的原核重组表达载体ＰＱＥ３０－Ｎ，利用表达纯化的蛋白为抗原，建立欧洲型ＰＲＲＳ抗体试剂盒和美洲型ＰＲＲＳ抗体试剂盒； ２）欧、美型ＰＲＲＳＶ抗体检测间接ＥＬＩＳＡ方法的建立： 利用纯化的美洲型及欧洲型ＰＲＲＳＶ Ｎ蛋白分别建立间接ＥＬＩＳＡ方法，确定美洲型Ｎ蛋白抗原包被浓度为４．５μｇ／ｍＬ，欧洲型Ｎ蛋白抗原包被浓度为８μｇ／ｍＬ；抗原包被条件均为３７℃ １ｈ加４℃包被过夜；血清的稀释度均为１∶４０，３０ｍｉｎ作为美洲型Ｎ蛋白包被时血清的工作时间，６０ｍｉｎ作为欧洲型Ｎ蛋白包被时血清的工作时间；使用１％的ＢＳＡ封闭，ＨＲＰ－兔抗猪ＩｇＧ的使用浓度均为１∶１０００，结合时间均为３０ｍｉｎ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王金宝，张祯涛，李俊，任慧英，吴家强，张秀美，丛晓燕，温建新，周顺，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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