一种人与动物旋毛虫病的检测方法及试剂盒技术

一种人与动物旋毛虫病的检测方法及试剂盒，利用旋毛虫排泄分泌物（ＥＳ）抗原，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）技术，检测人与动物旋毛虫病的抗体，通过抗原制备、抗原包被等方法制成检测试剂盒，本检测方法（试剂盒）在对人及动物旋毛虫病的检测，特异、敏感、简便快速，可检出１个虫体／每克肉，既适用于小批量屠宰又适用于大批量屠宰，３０分钟内可判定结果，制作成本低廉，可确保阳性猪的１００％检出。该发明专利技术克服了常规方法镜检法和集样消化法检测旋毛虫时存在的敏感性差，检验步骤繁琐等问题。从而大大地降低了工作量，该试剂盒还为人旋毛虫病的诊断提供了准确的诊断方法。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫吸附试验(ELISA)在检测(检验)人与动物旋毛虫病上的应用，提供了一种人与动物旋毛虫病的检测方法，并公开了适用于该检测方法的试剂盒，属于肉类食品检疫

技术介绍
目前，我国对于屠宰动物(猪)中旋毛虫的检验一般是采用“肉品卫生检验试行规程”的镜检法和集样消化法。然而这两方法均存在一定的弊端，镜检法费时费力而且敏感性差，其敏感性为肉中虫体密度达到每克肉中3个虫体时方可检出。集样消化法虽可大大提高检出率，敏感性为肉中虫体密度达到每克肉中1个虫体时可检出，该方法虽较镜检法在敏感性及检测时间上有所改进，但仍十分烦琐，因为在发现阳性样品时仍需对阳性组(20头)采用镜检法进行逐头镜检。对于其他屠宰动物旋毛虫病的检验主要参照猪旋毛虫病的检验，尚无具体的检验方法。对于人的旋毛虫病尚无有效的诊断方法，主要根据流行病学(有无食生肉或半生肉史)及临床症状进行诊断，但误诊率高达30％。
技术实现思路
本专利技术利用酶联免疫吸附试验(ELISA)提供了一种动物旋毛虫病的检测方法，克服了镜检法和集样消化法检测旋毛虫时存在的敏感性差，检验步骤烦琐等问题。本专利技术还提供了用于诊断人患旋毛虫病的诊断方法。本专利技术同时公开了适用于上述检测方法的试剂盒。本专利技术的技术解决方案如下利用旋毛虫排泄分泌物(ES)抗原，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术，检测人与动物旋毛虫病的抗体。具体方法包括以下工艺流程1、抗原制备1)旋毛虫肌幼虫收集采用国际旋毛虫标准虫种ISS534(中国分离株)制备抗原。取保种OF1小鼠，扑杀后，用人工胃液消化法收集肌幼虫，经口腔感染OF1小鼠，200-400条/只。30-40d后扑杀，以人工胃液消化法大量收集肌幼虫。2)旋毛虫排泄分泌物抗原(ES抗原)制备将人工胃液消化法收集的肌幼虫用细胞培养液(含有2mM谷酰胺，1％丙酮酸钠、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640细胞培养液)充分洗涤，并于37℃、5-10％二氧化碳培养箱中培养24h左右。3)用自然沉淀法祛除虫体，收集培养液。4)将培养液用3000 Da的透析袋进行透析浓缩，祛除小分子蛋白。5)对培养液进行纯度鉴定a)SDS-PAGE电泳应含20-30条蛋白带，b)涂板培养24-48h无菌落生长，c)280/260吸光度必须大于1。2、抗原包被1)将ES抗原用包被缓冲液(即碳酸盐缓冲液，取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水稀释至1000ml，调pH为9.6)稀释至1-10μg/ml。2)将稀释后的ES抗原包被96孔反应板，100μl/孔，4℃包被12-24h。3)用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板洗涤3次，30秒/次，每次洗涤后须甩干或拍干。4)用含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板进行封闭，100-300μl/孔，37℃，1-3小时。5)用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板洗涤3次，30秒/次，每次洗涤后须甩干或拍干。6)对反应板进行真空干燥并进行真空包装。3、检测试剂盒由以下试剂构成旋毛虫排泄分泌物抗原包被的反应板、阴性对照血清、阳性对照血清、固体清洗剂、酶标结合物、显色剂A液、显色剂B液、终止液；其中，固体清洗剂为磷酸盐缓冲液；酶标结合物包括用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗动物及人IgG抗体；A液磷酸二氢钠1.84g，过氧化氢脲0.03g，用时蒸馏水溶解并定容至50ml；B液先用1ml二甲基亚砜(DMSO)溶解10mg的四甲基联苯胺(TMB)，再取0.515g柠檬酸，将二者用于双蒸水溶解并定容至50ml；终止反应液配方2MH2SO4。本专利技术的使用方法如下1、样品稀释将固体清洗剂完全溶于500ml蒸馏水中配成洗液，用洗液将待检血清按1∶40稀释。2、加入一抗每孔加入稀释待检的血清100μl，同时设阴，阳性及空白对照，空白对照只加入洗液100μl，37℃，15分钟。甩净板中样品，加洗液满孔但不溢出，室温放置30秒，甩净，拍干。如此重复洗3次。3、加酶标结合物每孔加入酶标结合物100μl，37℃，15分钟。甩净板中样品，加洗液满孔但不溢出，室温放置30秒，甩净，拍干。如此重复洗5次。4、显色每孔加入显色剂A、B液各1滴，室温避光作用5-10分钟，可直接进行眼观观测结果。5、终止每孔加终止液50μl或1滴，立即用酶标仪测定OD值。结果判定1)眼观判定颜色深度等于或大于阳性对照者为阳性。2)OD值判定选波长450nm，空白调零，待检血清OD值与阴性对照OD值比值＞3者为阳性。本专利技术的积极效果在于本检测方法(试剂盒)在对人及动物旋毛虫病的检测，特异、敏感、简便快速，可检出1个虫体/每克肉，既适用于小批量屠宰又适用于大批量屠宰，30分钟内可判定结果，制作成本低廉，可确保阳性猪的100％检出。该专利技术克服了常规方法镜检法和集样消化法检测旋毛虫时存在的敏感性差，检验步骤烦琐等问题。从而大大地降低了工作量，该试剂盒还为人旋毛虫病的诊断提供了准确的诊断方法。从而使旋毛虫的检验达到既快速又准确。具体实施例方式实施例11、抗原制备1)旋毛虫肌幼虫收集采用国际旋毛虫标准虫种ISS543(中国分离株)制备抗原。取保种OF1小鼠，扑杀后，用人工胃液消化法收集肌幼虫，经口腔感染OF1小鼠，400条/只。35d后扑杀，以人工胃液消化法大量收集肌幼虫。2)旋毛虫排泄分泌物抗原(ES抗原)制备将人工胃液消化法收集的肌幼虫用细胞培养液(含有2mM谷酰胺，1％丙酮酸钠、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI1640细胞培养液)充分洗涤，并于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养24h。3)用自然沉淀法祛除虫体，收集培养液。4)将培养液用3000 Da的透析袋进行透析浓缩，祛除小分子蛋白。5)对培养液进行纯度鉴定a)SDS-PAGE电泳应含25条蛋白带，b)涂板培养24h无菌落生长，c)280/260吸光度必须大于1。2、抗原包被1)将ES抗原用包被缓冲液(即碳酸盐缓冲液，取碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水稀释至1000ml，调pH为9.6)稀释至5μg/ml。2)将稀释后的ES抗原包被96孔反应板，100μl/孔，4℃包被24h。3)用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板洗涤3次，30秒/次，每次洗涤后须甩干或拍干。4)用含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板进行封闭，300μl/孔，37℃，2小时。5)用含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(简称PBS-T，pH7.4)对反应板洗涤3次，30秒/次，每次洗涤后须甩干或拍干。6)对反应板进行真空干燥并进行真空包装。实施例2试剂盒的装配1)真空包装的ES抗原包被板(96孔/板)1块。2)阴、阳性对照样品各1管0.5ml/每管。3)固体清洗剂1袋每袋装有磷酸二氢钾(KH2PO4)0.1g，磷酸二氢钠(Na2HPO4·12H2O)1.45g，氯化钠(NaCl)4.0g，氯化钾(KCl)0.1g。使用时用蒸馏水稀释至500ml。4)辣根过氧化物酶(HRP)酶标二抗10ml(效价1∶2000)(针对不同本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人与动物旋毛虫病的检测方法，其特征在于：利用旋毛虫排泄分泌物（ＥＳ）抗原，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）技术，检测人与动物旋毛虫病的抗体，包括以下工艺流程：抗原制备：１）旋毛虫肌幼虫收集：采用国际旋毛虫标准虫种中国分 离株ＩＳＳ５３４制备抗原，取保种ＯＦ１小鼠，扑杀后，用人工胃液消化法收集肌幼虫，经口腔感染ＯＦ１小鼠，２００－４００条／只，３０－４０ｄ后扑杀，以人工胃液消化法大量收集肌幼虫；２）旋毛虫排泄分泌物ＥＳ抗原制备：将人工胃液消化法收集的 肌幼虫用细胞培养液充分洗涤，并于二氧化碳培养箱中培养；３）用自然沉淀法祛除虫体，收集培养液；４）将培养液用透析袋进行透析浓缩，祛除小分子蛋白；抗原包被：１）将ＥＳ抗原用碳酸盐缓冲液稀释；２）将稀释后的 ＥＳ抗原包被９６孔反应板，１００μｌ／孔，４℃包被１２－２４ｈ；３）用含０．０５％吐温－２０的洗涤液对反应板洗涤３次，３０秒／次，每次洗涤后须甩干或拍干；４）用封闭液对反应板进行封闭，１００－３００μｌ／孔，３７℃，１－３小 时；５）用含０．０５％吐温－２０的洗涤液对反应板洗涤３次，３０秒／次，每次洗涤后须甩干或拍干；６）对反应板进行真空干燥并进行真空包装。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明远，卢强，吴秀萍，付宝全，
申请(专利权)人：中国人民解放军军需大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]