人造牵引丝蛋白基因及其串联方法与表达技术

一种人造牵引丝蛋白基因及人造牵引丝蛋白基因的串联方法与表达，属于生物技术领域。本发明专利技术的目的是利用蛋白质中氨基酸种类与基因中核苷酸序列间存在对应关系的性质以及对密码子进行优化筛选，合成了人造牵引丝蛋白基因，及该人造牵引丝蛋白基因的串联方法与表达。本发明专利技术得到的人造牵引丝蛋白基因具备高弹性与高抗张强度。不同长度的人造牵引丝蛋白基因可表达不同长度的人造蛛丝蛋白。目的基因多拷贝顺序串联法能够简便、快捷的获得质粒载体可容纳范围内目的基因任意拷贝数的顺序串联片段，并且在保证不改变阅读框、不掺入无关氨基酸序列的前提下实现待串联肽段的核酸序列的定量、顺序串联，为实现不同蛋白的融合表达提供可能。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物

技术介绍
蜘蛛是一种能够在同一生物体内产生具有不同功能的多种丝的生物，丝的本质是蛋白质。蜘蛛牵引丝(dragline silk)是蜘蛛丝的一种，是自然界中集高抗张强度及高弹性于一体的奇特蛋白质。因其具备较钢铁更强的抗张强度，且其化学本质为蛋白质，故将其美誉为“生物钢蛋白”。除具备高抗张强度与高弹性之外，蜘蛛牵引丝蛋白还兼具了如质量轻、耐腐蚀、可生物降解等优良特性。因此，牵引丝蛋白在诸如生物医学装置(眼或神经外科用缝针线、人造肌腱等)、商业用途(高强度的包装材料、缆绳等)以及军事装备(防弹衣、降落伞等)等领域具有广阔的应用前景，是一种被世界普遍看好的生物材料。但由于蜘蛛无法实现人工群饲(因其个体异常凶猛，互相残食)，且不能像家蚕一般人为控制其产丝，因此很难实现大量收获天然的蜘蛛牵引丝。伴随现代生物技术的不断发展，越来越多的分子生物学研究者试图通过了解这一奇特物质的分子基础，利用基因工程手段实现牵引丝蛋白的人工合成与大量收获，为在多领域广泛应用这种“生物钢蛋白”提供可能。美国的Hinman与Lewis等研究小组发现，牵引丝蛋白主要由两种蛋白质核构成Spidroin1与Spidroin2。通过对不同产地、不同品系蜘蛛牵引丝的研究表明，牵引丝蛋白由明显的氨基酸基序依次串联而成，且其所含有的基序种类对应于牵引丝蛋白的物理性质。牵引丝蛋白中的氨基酸基序主要有AGR(GGL)，GGQGAGAn，GPGQQ，GPGGY，SGPGSAn等，其中富含丙氨酸的区域为牵引丝蛋白提供了相当的钢性，而含有脯氨酸的区域则赋予它一定的弹性。鉴于牵引丝蛋白所具有的这种特殊“模块性”，许多科研人员便试图利用这种特性，人工构造出满足要求的“人造牵引丝蛋白”。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用蛋白质中氨基酸种类与基因中核苷酸序列间存在对应关系的性质以及对密码子进行优化筛选，合成了人造牵引丝蛋白基因，及该人造牵引丝蛋白基因的串联方法与表达。本专利技术的核苷酸序列是gaa ttc atg gta ccc ccg ggt ggc tat ggt ccaPro Gly Gly Tyr Gly Proggt cag caa ggc cct tct ggt cca ggc agt gcaGly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Alagca gcc gca gca gcc gca gcc gga ccg gtt cta Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glygag gat atc aag ctt本专利技术人造牵引丝蛋白基因的串联方法与表达，以pUC18克隆质粒为载体，利用二次限制性内切酶双酶切反应及一次连接反应，构建出含有二个DNA单体数目的串联DNA单体二聚物，核苷酸序列测定表明成功实现了二个人造牵引丝蛋白基因DNA单体的串联，依此类推，也可以实现多个DNA单体的串联，利用限制性内切酶双酶切反应将获得的不同长度人造牵引丝蛋白基因从pUC18载体中切下，并将之连接至原核表达载体pET-28a中，经IPTG诱导，目的基因获得较好的表达。1、本专利技术得到的“人造牵引丝蛋白基因”完全具备为天然蛛丝蛋白提供高弹性与高抗张强度的氨基酸基序所对应的核苷酸序列；2、本专利技术得到的不同长度的“人造牵引丝蛋白基因”可表达不同长度的“人造蛛丝蛋白”；3、本专利技术得到的目的基因多拷贝顺序串联法能够简便、快捷的获得质粒载体可容纳范围内目的基因任意拷贝数的顺序串联片段，由此可获得相应长度的蛋白质表达产物——“人造牵引丝蛋白”，且此蛋白不会由于基因工程的操作过程而引入非牵引丝蛋白所需氨基酸序列，为人工获得蜘蛛牵引丝蛋白奠定基础。4、本专利技术得到的目的基因多拷贝顺序串联法能够在保证不改变阅读框、不掺入无关氨基酸序列的前提下实现待串联肽段的核酸序列的定量、顺序串联，为实现不同蛋白的融合表达提供可能。附图说明图1是本专利技术阳性重组质粒EcoRI和HindIII双酶切鉴定反应1％琼脂糖电泳结果。1DNA标准分子量λEcoI14I；9DNA标准分子量DL-2000；2~8pUC18-S2至pUC18-S8阳性重组质粒EcoRI和HindIII双酶切反应结果。图2是本专利技术不同数目DNA单体多聚物在大肠杆菌中表达情况的15％SDS-PAGE电泳图。1阴性对照；4低分子量蛋白质标准物；其余泳道从左至右分别为DNA单体二聚物至DNA单体八聚物在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达情况。图3本专利技术目的基因二拷贝串联策略示意图。具体实施例方式1.“人造牵引丝蛋白基因”的合成与克隆1.1引物合成CAG231F1cggaattcat ggtacccccg ggtggctatg gtccaggtcagcaaggcccttctggtccaggcagtgcagcagCAG231R1cgaagcttga tatcctctag aaccggtccg gctgcggctgctgcggctgctgcactgcctggacca1.1聚合酶链式反应在PCR管中分别加入CAG231F1(0.01 OD/μl)5μl，CAG231R1(0.01 OD/μl)5μl，10×TaKaRa LA Buffer 10μl，dNTP Mixture 16μl，H2O 63μl。94℃保温5min后，在10min内冷却至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1μl后，保温5min，72℃保温5min。此反应液为DNA延伸液。此DNA延伸液进行乙醇沉淀后，溶于100μl TE Buffer中。所获得的双链DNA分子即为“人造牵引丝蛋白基因”。1.2限制性内切酶酶切反应在微量离心管中分别加入DNA延伸液20μl，10×Buffer10μl，EcoR I 3μl，Hind III 3μl，加水补至100μl。37℃保温1hr，经乙醇沉淀后溶解于20μl TE缓冲液(pH8.0，10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，下同)中，此片段为待插入片段。1.3连接反应在微量离心管中分别加入待插入片段2μl，pUC18(EcoR I与Hind III双酶切)1μl，Ligation Solution I 5μl，H2O 2μl。16℃保温30min，连接液全量转化至E.coli JM109感受态细胞中。重组质粒命名为pUC18-S1。1.4DNA序列测定对重组质粒pUC18-S1进行核苷酸序列测定，测序结果同预期结果完全相符。1.大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌菌种，划线接种于不含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养16hr左右。挑取单一菌落，接种到100ml LB培养基中，37℃ 250rpm振摇培养约3hr(OD600＝0.4~0.6)；冰浴5min后，在无菌条件下将细菌培养液转移到无菌并以冰预冷的250ml聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，使培养物冷却到0℃；4℃ 5000~6000rpm离心10min，弃上清，以10ml冰预冷的100mmol/L CaCl2溶液充分重悬沉淀，冰浴15~30min，4℃6000rpm离心10min，弃上清，再以10ml冰预冷的100mmol/L C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人造牵引丝蛋白基因，其核苷酸序列是：ｇａａｔｔｃａｔｇｇｔａｃｃｃｃｃｇｇｇｔｇｇｃｔａｔｇｇｔｃｃａＰｒｏＧｌｙＧｌｙＴｙｒＧｌｙＰｒｏｇｇｔｃａ ｇｃａａｇｇｃｃｃｔｔｃｔｇｇｔｃｃａｇｇｃａｇｔｇｃａＧｌｙＧｌｎＧｌｎＧｌｙＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｒｏＧｌｙＳｅｒＡｌａｇｃａｇｃｃｇｃａ ｇｃａｇｃｃｇｃａｇｃｃｇｇａｃｃｇｇｔｔｃｔａＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｙｇａｇｇａｔａｔｃａａｇｃｔｔ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马鹤雯，张永亮，张立树，张玉静，郑伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军需大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]