本发明专利技术公开了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的检测方法，包括：步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-8启动子的质粒；步骤2，将步骤1所得质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞；步骤3，在步骤2所得细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合物，作用至少48h；步骤4，对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性，得到上皮细胞中IL-8的诱导表达倍数。本发明专利技术提供的检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中芳香胺类物质对人气道上皮细胞中IL-8表达的诱导作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及卷烟烟气毒理研究
，具体涉及一种卷烟烟气中芳香胺类化合 物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的检测方法。
技术介绍
慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范围 内一种发病率高、致残致死率高、且严重影响患者生活质量的疾病，同时会加重患者的经济 负担。 在各种致病因素中，吸烟是最重要的环境危险因素。据统计，由吸烟所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。国外有80 %~90 %的C0PD是 由吸烟引起的，我国约有72%的C0PD是由吸烟引起的。大量研究证实，C0PD气道炎症主要由中性粒细胞（PMN)、淋巴细胞和巨噬细胞等 炎症细胞浸润并被激活后释放大量细胞因子和炎性介质所致，其中TNF-α、IL-6、IL-8是 参与C0PD气道炎症的重要细胞因子。 IL-8主要由单核-巨噬和气道上皮细胞产生，具有激活PMN的细胞因子，可使PMN 趋化、脱颗粒进而释放溶酶体酶，并能促进T细胞趋化、游走，增强免疫应答，在疾病发生、 发展中起重要作用。目前已有研究发现，应用动物或人的气道上皮细胞，采用卷烟提取物或全烟气暴 露模型均发现能显著诱导气道上皮细胞中IL-8的表达，比较吸烟者和非吸烟者肺组织及 血液中IL-8的表达量发现二者具有显著差异。 卷烟烟气是多种化合物组成的复杂混合物，截止1988年（据Roberts， 1988TobaccoR印orter报道）已经鉴定出烟气中的化学成分达5068种，其中1172种是烟 草本身就有的，另外3896种是烟气中独有的。美国健康基金会副董事长D.霍夫曼博士列 出卷烟烟气中的44种主要有害成分，除焦油、烟碱和一氧化碳这些主要成分外，其他大致 可分为九类：①氨；②四种芳香胺③苯并芘；④八种醛酮类化合物；⑤氢氰酸；⑥七种无机 元素；⑦七种酚类化合物；⑧四种烟草特有亚硝胺；⑨其他挥发性有机成分。 芳香胺类物质具有一定的致癌作用，目前尚无芳香胺类物质对肺部炎症的相关系 统研究。
技术实现思路
本专利技术提供了一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的 检测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中各种芳香胺类物 质对人气道上皮细胞中IL-8表达的诱导作用。 -种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL-8表达的检测方法，包 括： 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-8启动子的IL-8-promotor-pGL6质粒； 步骤2,将IL-8-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到 IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞； 步骤3,在IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合 物，作用至少48h; 步骤4,对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性， 得到上皮细胞中IL-8的诱导表达倍数。 本专利技术选取人气道上皮细胞中IL-8启动子序列-1475-+1作为靶标序列，利用PCR 扩增该序列，并克隆到具有荧光素酶报告基因和G418筛选标记的PGL6质粒中，将测序验证 正确的质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，将转染后的细胞与卷烟提取物相作用，获得 上皮细胞中IL-8的表达程度。 作为优选，IL-8-promotor_pGL6质粒的构建方法如下： 步骤1-1、设计IL-8启动子-1475-+1的引物序列如下：上游引物为：5'-GCACTCGAGTAACCCAGGCATTATT-3'（序列如SEQIDN0 :1 所示的 DNA序列）；下游引物为：5'-GCTAAGCTTAGTGCTCCGGTGGCTTTT-3'（序列如SEQIDN0 :2 所示 的DNA序列）； 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-8启动子序 列； 步骤1-2、利用ΚρηI和XholI双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用 T4DNA连接酶连接至少24h，得到IL-8-promotor-pGL6质粒。 作为优选，步骤1-1中PCR反应的条件如下： 变性、退火、延伸循环28~30次。 作为优选，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。 作为优选，利用Lipofectamine3000转染试剂将IL_8-promotor-pGL6质粒转染入 人气道上皮细胞16HBE中，然后采用G418筛选得到IL-8-promotor-pGL6-16HBE细胞。 作为优选，步骤3中，芳香胺类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16HBE产生 细胞毒性的最大量。 本专利技术提供的检测方法，具有以下优点： (1)由于卷烟烟气进入人体气道后主要作用细胞，本专利技术采用人气道上皮细胞作 为研究对象，更接近吸烟的实际状态。 (2)特异性的选取人气道上皮细胞中IL-8的启动子序列，使检测更加具有针对性 和特异性。 (3)建立IL-8-promotor-PGL6-16HBE稳转细胞，不用反复瞬时转染质粒，使筛选 更加快速和经济。 (4)采用荧光素酶报告基因作为最终检测指标，灵敏度高。【附图说明】 图la表示1-氨基萘对16HBE的细胞毒作用； 图lb表示3-氨基联苯对16HBE的细胞毒作用； 图2a表示1-氨基萘对16HBE中IL-8表达的诱导作用； 图2b表示3-氨基联苯对16HBE中IL-8表达的诱导作用； 图3为PGL6质粒图谱； 图4表示卷烟提取物对人气道上皮细胞中IL-8的诱导作用。【具体实施方式】 实施例1 芳香胺类物质是卷烟主流烟气中的主要物质之一，主要有如1-氨基萘，2-氨基 萘，1-氨基联苯，3-氨基联苯等。为检测这些芳香胺类物质是否是吸烟导致肺部炎症的主 要化合物，对1-氨基萘和3-氨基联苯是否会诱导人气道上皮细胞中IL-8的表达进行检 测，包括以下步骤： 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL-8启动子的IL-8-promotor-pGL6质粒， 构建方法如下： 步骤1-1、设计IL-8启动子-1475-+1的引物序列如下： 上游引物为：5 ' -GCACTCGAGTAACCCAGGCATTATT-3 ' ； 下游引物为：5' -GCTAAGCTTAGTGCTCCGGTGGCTTTT-3' ； 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增IL-8启动子序列。 PCR反应体系包括： 模板（即16HBE总基因组DNA) 1μ[; 上游引物（ΙΟμΜ) 1.5pL; 下游引物（ΙΟμΜ) 1.5μL; 2xPCRbufferforKODFX 25μL; 2mMdNTPsΙΟμL; K(3DFX(i.0U/,uL) l.uL; Autoclaved,distilledwater 10μL; 总体积 PCR反应的条件如下： 将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶，110V，20min电泳分离后，得到的扩增条带中的目 的条带约680bp切下，用GelExtractionKitDNA纯化试剂盒进行纯化。 步骤1-2、采用ΚρηI和XholI双酶切纯化产物5h，同时采用ΚρηI和XholI双 酶切2μg质粒载体pGL65h，再次纯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种卷烟烟气中芳香胺类化合物体外诱导上皮细胞中IL‑8表达的检测方法，其特征在于，包括：步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有IL‑8启动子的IL‑8‑promotor‑pGL6质粒；步骤2，将IL‑8‑promotor‑pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到IL‑8‑promotor‑pGL6‑16HBE细胞；步骤3，在IL‑8‑promotor‑pGL6‑16HBE细胞中加入卷烟烟气中的芳香胺类化合物，作用至少48h；步骤4，对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性，得到上皮细胞中IL‑8的诱导表达倍数。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周国俊，储国海，肖卫强，卢昕博，沈凯，夏倩，胡雅军，许成云，吴希美，
申请(专利权)人：浙江中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。