本发明专利技术公开了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。本发明专利技术所述RIP3蛋白激酶活性检测方法无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作。利用本发明专利技术所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法，能够高效特异地筛选RIP3蛋白激酶抑制剂，并发现索拉菲尼和威罗菲尼具有RIP3蛋白激酶抑制活性。本发明专利技术所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒具有特异性高，使用方法简便的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种RIP3蛋白激酶的活性检测方法以及RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法。
技术介绍
受体相互作用蛋白家族(receptor-interacting proteins，RIPs)是蛋白激酶家族的一个重要分支，其功能上具有特异的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶活性，属于Ser/Thr蛋白激酶家族。，目前用于蛋白激酶活性检测的方法主要包括以下几类：1.基于抗原抗体原理的ELISA方法，通过用蛋白激酶底物包被多孔板板底，加入激酶及反应液反应后，分别用针对磷酸化底物的抗体（一抗）以及针对一抗的抗体（二抗）进行孵育，通过化学发光等方式检测激酶催化底物磷酸化的程度，从而评价其活性并用于抑制剂筛选。但受蛋白纯化程度以及底物自身磷酸化影响，无法排除非特异性磷酸化的干扰，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性。此外该方法价格昂贵、耗时长、操作步骤多，制约了化合物的高通量筛选。2.放射性同位素标记法，蛋白激酶可催化P32标记的ATP反应从而将P32基团转移到底物对其进行标记，通过放射自显影检测底物被P32标记的程度评价酶活及抑制剂对酶促反应的抑制程度。该方法特异性程度高，但缺点显著，包括对研究场所有严格限制，易造成环境污染，对研究者健康有潜在危害，且难以实现抑制剂的高通量筛选。该方法是目前用于RIP3（受体相互作用蛋白-3）酶活检测及抑制剂筛选的唯一方法。具体方法为从Jurkat细胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋白，在反应液中和10μCi[32P]γ-ATP和5μg MBP在30℃孵育30分钟，随后进行放射自显影。反应液成分为：20mM HEPES[pH7.5]，2mM DTT，1mM NaF，1mM Na3VO4，20mMβ-glycerophosphate，20mM MgCl2，20mM MnCl2，1mM EDTA，300μM ATP。3.ATP消耗法，该方法主要包括两步反应，第一步反应是蛋白激酶催化酶促反应消耗反应体系中的ATP用于磷酸化底物，该反应中部分ATP被转化为ADP；第二步反应是利用荧光素酶消耗特定激酶酶促反应后剩余的ATP氧化荧光素氧同时发出荧光。其作用原理如图1所示，将一定量的特定蛋白激酶与底物置于反应缓冲液中，加入ATP后在一定条件下进行酶促反应，反应一定时间后，终止激酶反应并启动荧光素酶消耗ATP的氧化反应以释放荧光。在一定范围内酶促反应后ATP剩余量与荧光强度成线性正相关，而特定激酶催化的酶促反应程度又与ATP剩余量成线性负相关。若荧光强度强，表明激酶催化反应后体系中剩余ATP多，说明酶促反应消耗掉的ATP较少，酶促反应程度弱。若荧光强度弱，表明激酶催化反应后体系中剩余ATP少，说明酶促反应消耗ATP多，酶促反应程度强。因而荧光强度与酶促反应成线性负相关，可通过检测荧光强度来评价酶促反应的程度。但由于蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性和精确性。ATP消耗法被用于多种激酶检测，但目前针对RIP3蛋白(受体相互作用蛋白-3)仍有以下问题未解决：1.RIP3蛋白属于RIP蛋白家族，为丝苏氨酸激酶，与其它家族丝苏氨酸激酶相比，一级结构具有显著差异，并且目前晶体结构未知。除放射性同位素法外，至今尚无其它酶活检测方法报道；2.ATP消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，此外包括底物浓度、ATP浓度、反应温度、反应时间等因素，均会影响目标蛋白酶活，因而无法直接用于抑制剂筛选；3.目前尚未发现针对RIP3的抑制剂。
技术实现思路
因此，本专利技术所要解决的技术问题是针对目前RIP3蛋白激酶活检测方法较为局限，ATP消耗法方法无法直接用于RIP3蛋白激酶抑制剂筛选的问题，提供了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术提出的解决方案之一为：一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其中所述筛选方法包括以下步骤：（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。其中步骤（1）所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1mM；较佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM，MgCl25mM，MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM，二硫苏糖醇0.05mM，所述反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白的浓度更佳地为30ng/μl，ATP的浓度更佳地为10μM。其中步骤（1）所述反应体系溶液pH更佳地为7.0，反应温度更佳地为25℃，震荡速度较佳地为50～100RPM，更佳地为100RPM，反应时间更佳地为75分钟。其中步骤（2）所述检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度的方法为本领域常规方法，较佳地为利用荧光信号进行检测。所述的方法较佳地包括以下步骤：向步骤（1）所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶并检测发光信号。该检测方法可以利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒。根据所得发光值计算特异性反应率，所得特异性反应率%=（无MBP时的发光值-有MBP时的发光值）/无MBP时的发光值×100%。步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法较佳地包括以下步骤：反应结束后将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。
【技术特征摘要】
1.一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法
包括以下步骤：
（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应
缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制
剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性
蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为
10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应
时间为60～90分钟；
（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓
度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。
2.如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，
步骤（1）所述反应缓冲液的组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～10mM，
MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM，EGTA
0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇0.02mM～0.1
mM。
3.如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，
步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法
包括以下步骤：反应结束后加入荧光素和荧光素酶并检测特异性反应率，将
加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋
白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的
抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反
应率×100%。
4.如权利要求1所述的RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，
步骤（1）所述反应缓冲液的pH值为7.0，反应温度为25℃，震荡的速度为
50～100RPM，反应时间为75分钟。
5.一种RIP3蛋白激酶抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包
【专利技术属性】
技术研发人员：魏世英，匡海门，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：匡海门，
类型：发明
国别省市：上海;31
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