一种二噁英类持久性有机污染物检测方法技术

一种二噁英类持久性有机污染物检测方法，涉及一种基因工程。按照设计从斑马鱼染色体DNA上PCR扩增出CYP1A启动子序列，构建含有luciferase基因，TA box的PGL6‑TA‑pCYP1A质粒。通过改造CYP1A启动子，提高重组质粒对TCDD的检测效率，建立了一个快速，高效的检测TCDD以及同样是AHR配体的毒物的系统。利用斑马鱼cyp1a基因启动子序列，利用overlap pcr技术对其进行改造，连接到PGL6‑TA载体中，使改造完成的启动子序列对二噁英类持久性有机污染物的敏感度加强，转染到HepG2细胞中，能够快速检测环境中二噁英类持久性有机污染物。

【技术实现步骤摘要】
201610167440

【技术保护点】
一种二噁英类持久性有机污染物检测方法，其特征在于其具体步骤如下：1)以National Center for Biotechnology Information网站上已知的斑马鱼基因组序列为模板设计一对引物pCYP1A‑F,pCYP1A‑R，克隆CYP1A(Chromosome 18‑NC_007129.6)启动子序列，引物序列如下：pCYP1A‑F：5’－AAAGGTACCGAAACCCACGCCATGCAAAC－3’                 Kpn IpCYP1A‑R：5’－AAAAAGCTTTCCTCCGCGTGACGTCACCG－3’                Hind III其中在CYP1A启动子序列的上游引物设置了Kpn I酶切位点，在下游引物设置了Hind III酶切位点，以斑马鱼基因组为模板，以上述两条引物，利用PCR技术扩增出启动子序列：该启动子序列位于CYP1A基因的表达起始密码子ATG的上游314个碱基；将扩增出来的片段经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A，将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；2)用得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，设计引物pCYP1A‑2×DRE‑F,pCYP1A‑2×DRE‑R，进行overlap PCR，对启动子序列进行改造，引物序列如下：2×DRE‑1F：5’‑TGTTACATACATCAATCTCC‑3’2×DRE‑2F：5’‑ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAATCTCC‑3’                       芳香烃受体结合位点2×DRE‑1R：5’‑CACGCACACATACATGGTAC‑3’2×DRE‑2R：5’‑CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATGGTAC‑3’改造后序列示意：以pCYP1A‑F，2×DRE‑1R为引物，PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列1；2×DRE‑1F，pCYP1A‑R为引物，PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列2；pCYP1A‑F，2×DRE‑2R为引物，序列1为模板，PCR扩增扩增出序列3；2×DRE‑2F，pCYP1A‑R为引物，序列2为模板，PCR扩增扩增出序列4；以pCYP1A‑F，pCYP1A‑R为引物，模板同时加入序列3和序列4，扩增出目的序列pCYP1A‑2×DRE，先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，用得到的质粒经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE，将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE送到生工公司以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；3)用得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE为模板，设计引物3×DRE‑F,3×DRE‑R，进行overlap PCR，对启动子序列进一步改造；引物序列如下：3×DRE‑F：5’－ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAAT－3’3×DRE‑R：5’－CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATGGTAC－3’改造后序列示意：以pCYP1A‑F，3×DRE‑R为引物，序列3为模板，PCR扩增出序列5；3×DRE‑F，pCYP1A‑R为引物，序列4为模板，PCR扩增扩增出序列6；以pCYP1A‑F，pCYP1A‑R为引物，模板同时加入序列5和序列6，扩增出目的序列pCYP1A‑3×DRE；先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，用得到的质粒经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE；将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE送到生工公司以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；4)用得到的...

【技术特征摘要】
1.一种二噁英类持久性有机污染物检测方法，其特征在于其具体步骤如下：
1)以NationalCenterforBiotechnologyInformation网站上已知的斑马鱼基因组
序列为模板设计一对引物pCYP1A-F,pCYP1A-R，克隆CYP1A(Chromosome18-NC_007129.6)
启动子序列，引物序列如下：
pCYP1A-F：5’－AAAGGTACCGAAACCCACGCCATGCAAAC－3’
KpnI
pCYP1A-R：5’－AAAAAGCTTTCCTCCGCGTGACGTCACCG－3’
HindIII
其中在CYP1A启动子序列的上游引物设置了KpnI酶切位点，在下游引物设置了Hind
III酶切位点，以斑马鱼基因组为模板，以上述两条引物，利用PCR技术扩增出启动子序列：
该启动子序列位于CYP1A基因的表达起始密码子ATG的上游314个碱基；将扩增出来的
片段经KpnI/HindIII双酶切后回收序列片段，并与经KpnI/HindIII双酶切的实验室原
有的质粒载体PGL6-TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得
重组质粒PGL6-TA-pCYP1A，将得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A以Rvprimer3通用引物进行
测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；
2)用得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A为模板，设计引物pCYP1A-2×DRE-F,pCYP1A-2×
DRE-R，进行overlapPCR，对启动子序列进行改造，引物序列如下：
2×DRE-1F：5’-TGTTACATACATCAATCTCC-3’
2×DRE-2F：5’-ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAATCTCC-3’
芳香烃受体结合位点
2×DRE-1R：5’-CACGCACACATACATGGTAC-3’
2×DRE-2R：5’-CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATGGTAC-3’
改造后序列示意：
以pCYP1A-F，2×DRE-1R为引物，PGL6-TA-pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列1；2×
DRE-1F，pCYP1A-R为引物，PGL6-TA-pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列2；pCYP1A-F，2×
DRE-2R为引物，序列1为模板，PCR扩增扩增出序列3；2×DRE-2F，pCYP1A-R为引物，序列2为
模板，PCR扩增扩增出序列4；以pCYP1A-F，pCYP1A-R为引物，模板同时加入序列3和序列4，扩
增出目的序列pCYP1A-2×DRE，先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，
用得到的质粒经KpnI/HindIII双酶切后回收序列片段，并与经KpnI/HindIII双酶切的
实验室原有的质粒载体PGL6-TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选
克隆子，得重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-2×DRE，将得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-2×DRE
送到生工公司以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；
3)用得到的重组质粒PGL6-TA-pCYP1A-2×DRE为模板，设计引物3×DRE-F,3×DRE-R，
进行overlapPCR，对启动子序列进一步改造；
引物序列如下：
3×DRE-F：5’－ACTGCGAGCCCCCTCGCGT...

【专利技术属性】
技术研发人员：左正宏，杜宏，王重刚，张龙兴，周懿翕，沈超，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35