一种粗酶制剂、其制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术领域，具体涉及一种粗酶制剂、其制备方法及应用，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。发明专利技术首次构建了包含γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因和磷酸激酶编码基因的重组载体，将该重组载体转化宿主菌，获得工程菌株，发酵该工程菌株可获得包含γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的粗酶制剂。

Crude enzyme preparation, preparation method and application thereof

The invention relates to the technical field of biological engineering, in particular to a crude enzyme preparation, preparation method and application thereof, wherein the crude enzyme including gamma glutamyl phosphate synthase kinase and methylamine; among them, the gamma glutamyl phosphate synthase and methylamine kinase gene cloning in the same expression vector. Is the first time to construct recombinant vector containing gamma glutamyl methylamine synthase encoding gene and phosphoglycerate kinase encoding gene, the recombinant plasmid was transformed into host bacteria, engineering strain, fermentation of the engineering strain can be obtained with crude enzyme preparations containing gamma glutamyl phosphate synthase kinase and methylamine.

【技术实现步骤摘要】
一种粗酶制剂、其制备方法及应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种粗酶制剂、其制备方法及应用，特别涉及一种通过基因克隆表达制备的粗酶制剂及其用于合成茶氨酸的应用。
技术介绍
L-茶氨酸(C7H14O3N2，又称γ-谷氨酰乙胺)是茶叶中所含的一种特殊氨基酸，具有多种用途：在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等；在保健食品中用于镇静放松、改善睡眠、抗疲劳、提高学习记忆能力等；在医药领域已用于降低血压、预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等。因此L-茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛的需求。酶法是近年来合成L-茶氨酸的新趋势。目前，专利和文献所报道的生产L-茶氨酸的酶主要有CN102181501A和CN103409475A公开了γ-谷氨酰转肽酶，CN1688705A和JP2007185132A公开了谷氨酰胺酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71(2),545-552”公开了谷氨酰胺合成酶，“Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”和CN104212757A公开了γ-谷氨酰甲胺合成酶，都具有生产生产L-茶氨酸的功能。与传统的化学方法相比，酶催化制备方法效率高、专一性强、反应条件温和，是一种理想的制备L-茶氨酸的方法。但是γ-谷氨酰转肽酶和谷氨酰胺酶所用底物谷氨酰胺价格相对昂贵，且会使该底物水解，需要添加过量的另一种底物乙胺来抑制。谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶可转化价格低廉的谷氨酸钠和等当量的乙胺合成L-茶氨酸，但其为耗能反应，需要消耗当量的ATP。目前有“Biosci.Biotechnol.Biochem.2005,69,784-789；Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”报道利用酵母发酵能量循环来解决这一问题。除酵母体系外，通过酶催化也可实现ATP再生，且酶法ATP再生效率高、不需考虑透膜问题、反应体系简单、易控。而目前尚无将ATP特异性再生的酶应用于茶氨酸合成体系的报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种粗酶制剂、其制备方法及应用，所述粗酶制剂能够催化合成茶氨酸并同时实现反应中ATP再生。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种粗酶制剂，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。本专利技术中，将γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶克隆在同一个载体上，磷酸激酶能将ADP转换为ATP，为γ-谷氨酰甲胺合成酶生产L-茶氨酸提供一部分所需的ATP，达到ATP的再生循环利用。本专利技术粗酶制剂中，γ-谷氨酰甲胺合成酶的酶活为500-1000U/g，磷酸激酶的酶活为1000-2000U/g；其中，酶活单位分别定义如下：1Uγ-谷氨酰甲胺合成酶为37℃下每分钟催化生成1μmolγ-谷氨酰羟肟酸所需的酶量；1U磷酸激酶为30℃下每分钟催化生成1mgATP所需的酶量。作为优选技术方案，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorusmays。优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichiacoli、Rhodobactersphaeroides或Chloroflexusaurantiacus中的任意一种。优选地，所述粗酶制剂的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段。所述核苷酸序列如下：SEQIDNO.1：ATGATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGACGCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGAGTCGACAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTGGAAGAAGCACAAAAGTTTCTGGAAGACCACCATGTCAAGTATGTCCTGGCACAGTTCGTCGATATTCACGGCGTTGCTAAAGTGAAGAGCGTTCCGGCGTCTCATCTGAATGATATTCTGACCACGGGTGCAGGTTTTGCAGGCGGTGCTATTTGGGGTACCGGTATCGCACCGAACGGTCCGGATTATATGGCAATTGGTGAACTGAGTACGCTGTCCCTGATCCCGTGGCAGCCGGGTTATGCACGTCTGGTCTGCGACGGCCACGTGAATGGTAAACCGTATGAATTTGATACCCGTGTGGTTCTGAAACAGCAAATTGCACGTCTGGCAGAAAAGGGTTGGACCCTGTATACGGGTCTGGAACCGGAATTTTCACTGCTGAAAAAGGATGAACATGGCGCGGTGCACCCGTTCGATGACTCGGACACGCTGCAAAAACCGTGTTATGATTACAAGGGTATTACCCGCCATAGCCCGTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粗酶制剂，其特征在于，所述粗酶制剂包括γ‑谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；其中，所述γ‑谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。

【技术特征摘要】
1.一种粗酶制剂，其特征在于，所述粗酶制剂包括γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶；其中，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。2.根据权利要求1所述的粗酶制剂，其特征在于，所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorusmays；优选地，所述磷酸激酶来源于Eschierichiacoli、Rhodobactersphaeroides或Chloroflexusaurantiacus中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的粗酶制剂，其特征在于，所述粗酶制剂的核苷酸序列包含如SEQIDNO.1所示的片段。4.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码如权利要求1-3中任一项所述的粗酶制剂。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的DNA片段。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括启动子、第一核糖体结合位点、γ-谷氨酰甲胺合成酶和第一终止子、第二核糖体结合位...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，刘珊，李元，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12