P60抑制剂与cart细胞联合应用制造技术

本发明专利技术公开了Treg细胞抑制剂P60与CART细胞联合应用方法，主要包括以下步骤：1)Treg细胞抑制剂P60的构建；2)CART细胞构建；3)P60加入到CART细胞中并检测CART细胞增殖与功能。本发明专利技术制备的CART细胞增殖能力强，细胞功能好。

【技术实现步骤摘要】
P60抑制剂与cart细胞联合应用
本专利技术涉及一种工程T细胞，其制备方法及其作为药物的用途，特别是用于免疫治疗。本专利技术的工程T细胞被设计用于局部表达调控T细胞(Treg)的分泌抑制剂。分泌抑制剂是叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3)的肽抑制剂，FoxP3是参与T细胞向调节性T细胞分化的特异性因子。所述T细胞优选具有针对在恶性或感染细胞表面表达的至少一种抗原的嵌合抗原受体(CAR)。因此本专利技术的工程化T细胞将其免疫活性导向特定的恶性或受感染细胞，同时阻止相邻的调节性T细胞调节免疫反应。。
技术介绍
嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor-Tcell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。CAR-T细胞回输治疗是当前肿瘤治疗中最明确有效的免疫治疗形式。大量研究表明，CAR-T细胞可以有效的识别肿瘤抗原，引起特异性的抗肿瘤免疫应答，显著改善患者的生存状况。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。虽然细胞毒性T淋巴细胞(CTL；也称为细胞毒性T细胞)和T辅助细胞在细胞免疫应答中起重要作用，但调节性T细胞(Tregs)，以前称为抑制性T细胞，调节或抑制免疫反应，特别是预防自身免疫和维持对自身抗原的耐受性。由于它们的免疫调节功能，在癌症或感染部位存在调节性T细胞可能阻碍诱导针对癌症或感染性病原体的免疫应答(AandahlE.M.etal.(2004)；CabreraR.etal.(2004)；ViguierM.etal.2004)；WooE.Y.etal(2001))。因此，在某些致病情况下，例如慢性感染性疾病或癌症，可能需要抑制调节性T细胞的活性以允许发生更有效的免疫应答。另一方面，开发疫苗策略基于以下发现：通过降低调节性T细胞的活性可以改善疫苗功效，例如通过控制叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3)的活性。特别是FOXP3的一种肽抑制剂P60，被发现可以提高小鼠的疫苗效力(Casaresetal.，2010)。Lee,J.C.etal.CancerRes2011,71:2871-2881报道了Tregs对CD19CAR-工程化效应T细胞的抑制作用。然而，FOXP3的功能障碍与严重的自身免疫疾病如系统性红斑狼疮或X性连锁多内分泌腺病、肠病伴免疫失调综合征(IPEX)综合征相关，使得针对例如FoxP3的抑制剂的全身给药目前不被认为是免疫治疗中的合适选择。这些抑制剂在血液中甚至在局部释放可能通过释放未受原发性疾病影响的器官的自身免疫反应而导致毒性作用。因此，需要新的治疗策略来促进有效的免疫反应，同时减少身体未受影响区域可能出现的毒性副作用。本专利技术通过提供调节性T细胞的特异性原位抑制作为CAR免疫疗法的一部分来解决这种需要。
技术实现思路
本专利技术涉及通过异源表达FoxP3的细胞穿透肽抑制剂来制备能够在病理细胞的密闭环境中中和调节性T细胞活性的工程化T细胞的方法。根据本专利技术的另一个方面，该方法可以更具体地应用于通过嵌合抗原受体与病理细胞相互作用的T细胞。这种方法更具体地包括以下一个或几个步骤：a)提供T细胞；b)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包括针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；和c)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含细胞穿透肽抑制剂FoxP3的核苷酸序列编码。“调节性T细胞抑制剂”是指由T细胞分泌的所述分子的分子或前体，其允许T细胞逃避由调节性T细胞在其上进行的下调活性。通常，这种调节性T细胞活性抑制剂具有降低所述细胞中FoxP3转录活性的作用。根据本专利技术，所述调节性T细胞活性抑制剂是FoxP3的细胞穿透性肽抑制剂，例如称为P60(Casaresetal.，2010)。根据优选实施例，工程T细胞同时在其表面表达CAR，该CAR结合病理细胞的表面抗原标记物。这种结合可以引起T细胞对病理细胞的免疫反应，导致细胞间空间内各种细胞因子和降解酶的脱粒。根据具体实施例，该方法包括进一步将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体。引入上述核酸后，所述第二嵌合抗原受体可由所述T细胞表达。所述第二CAR针对所述调节性T细胞，主要是为了将所述调节性T细胞物理维持在T细胞(以及病理细胞)的近距离环境中，以获得对所述调节性T细胞的原位抑制。第二CAR也有助于激活T细胞的免疫反应。根据任选的实施方案，该方法还包括通过灭活编码T细胞受体(TCR)的一种组分的至少一种基因来使T细胞非同种异体反应的步骤。这可以通过向细胞中引入靶向该基因的特定稀有切割内切核酸酶来实现，例如TAL-核酸酶，CAS9RNA引导的核酸内切酶，锌指核酸酶或大范围核酸酶。因此，本专利技术优选地提供了工程T细胞，特别是基因工程分离的T细胞，包括:a)一种外源性核酸分子，包括针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；和b)外源性核酸分子，包括编码FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列，如P60(Casaresetal.，2010)。根据优选实施例，所述第一嵌合抗原受体和所述FoxP3细胞穿透肽抑制剂由所述T细胞表达。根据其他实施例，该工程T细胞进一步包括c)外源性核酸分子，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于第二嵌合抗原受体，该受体针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原。根据具体实施例，所述第二嵌合抗原受体由所述T细胞表达。本专利技术还进一步提供了分离的核酸分子，该核酸分子包含针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一个抗原的嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列编码；以及FoxP3细胞穿透肽抑制剂的核苷酸序列编码，优选FoxP3细胞穿透肽抑制剂，如P60(Casaresetal.，2010)。根据某些实施例，所述核酸分子是载体，如病毒载体或质粒。更具体地说，所述核酸分子是载体，如病毒载体或质粒，所述核苷酸序列与一个或多个适于在T细胞中表达的启动子操作连接。本专利技术还提供了一种组合物，该组合物包括一个或多个核酸分子，该核酸分子包含针对恶性或受感染细胞表面表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备工程T细胞的方法，包括以下步骤:/na)将包含核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入已提供的T细胞，该核苷酸序列编码用于针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)；和/nb)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含编码细胞穿透肽抑制剂FoxP3的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备工程T细胞的方法，包括以下步骤:
a)将包含核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入已提供的T细胞，该核苷酸序列编码用于针对恶性或受感染细胞表面表达的至少一种抗原的第一嵌合抗原受体(CAR)；和
b)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含编码细胞穿透肽抑制剂FoxP3的核苷酸序列。


2.根据权利要求1的方法，其中FoxP3的细胞穿透肽抑制剂是包含SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽或其包含具有至少60％氨基酸序列的变体，例如，在编码FoxP3的细胞穿透肽抑制剂的SEQIDNO：1序列的整个长度上，与SEQIDNO：1所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性。


3.根据权利要求1或2的方法，进一步包括以下步骤:
a)将外源性核酸分子引入所述T细胞，该外源性核酸分子包含一个核苷酸序列，该核苷酸序列编码用于针对调控T细胞(Treg)表面表达的至少一个抗原的第二嵌合抗原受体；
b)将含有核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入该T细胞，该核苷酸序列编码用于一种罕见切割的内切核酸酶，该内切核酸酶可通过DNA裂解选择性失活T细胞受体(TCR)某一组分的至少一个基因编码；
c)将含有核苷酸序列编码的外源性核酸分子引入该T细胞，该核苷酸序列编码用于一种罕见切割内切酶，该内切酶可通过DNA裂解表面抗原CD25的基因编码而选择性失活；和/或
d)扩增产生的工程T细胞。


4.根据权利要求1至3中任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海鹰，王赛赛，
申请(专利权)人：上海恒润达生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31