本发明专利技术涉及一种高效表达猪瘟E2‑IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。该重组CHO细胞株经载有人工合成的E2‑IL1基因序列的载体转染，通过单克隆细胞筛选，获得表达E2‑IL1融合蛋白的重组细胞株；扩大培养至6孔板阶段即可实现无血清悬浮培养，缩短了培养时间，提高了表达量；用该E2‑IL1融合蛋白与佐剂ISA 206 VG制成疫苗免疫仔猪能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，血清学检测结果不仅能够产生并检测到针对E2的中和抗体，同时能够在血清中检测到较高的干扰素‑γ以及能够检测到较强的淋巴细胞增殖反应。本发明专利技术构建的重组CHO细胞株不仅能够高表达E2‑IL1融合蛋白，而且可以实现抗原蛋白的无血清、大规模、稳定生产，该细胞株可以应用于猪瘟E2亚单位疫苗的研发。
A recombinant CHO cell line with high expression of CSFV e2-il1 fusion protein and its construction and Application
【技术实现步骤摘要】
一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
猪瘟病毒(CSFV)传染性强，传播速度快，分布范围广，给养殖业带来很大经济损失。我国从1956年开始提出猪瘟净化，如今猪瘟仍在我国不间断流行。目前市场上在售的猪瘟疫苗均为传统疫苗包括猪瘟灭活疫苗和猪瘟弱毒活疫苗。全病毒疫苗虽然免疫效果好，但是由于其存在灭活不彻底，毒力返强，基因突变造成新的毒株出现等风险，另外也由于全病毒疫苗无法区别免疫与野毒感染，为猪瘟净化带来困难。随着猪瘟净化的日趋紧迫，猪瘟病毒亚单位疫苗成为未来市场的一个焦点。CSFV为有囊膜单股正链RNA病毒，其中结构蛋白E2分子量为55kDa，是保守性最低、最易变异的分子，也是最主要的免疫保护性蛋白。白细胞介素-1(IL-1)又称淋巴细胞激活因子，成熟的白介素-1分子可以诱导白介素-2的释放、促进B细胞成熟与增殖、干扰素-γ产生，从而进而影响机体的免疫反应。CHO细胞为上皮贴壁型细胞，是由仓鼠卵巢分离获得，相较于其他的表达系统，CHO细胞能够对重组基因进行高效表达、并能够对表达蛋白进行翻译后修饰，其表达产物更接近于天然蛋白分子，作为疫苗能够产生更好的免疫攻毒保护。CHO细胞包括DG44、DXB11、CHOK1等。基于CHO-K1细胞的表达平台多采用GS(谷氨酰胺合成酶)筛选系统和/或抗生素筛选系统。采用GS筛选系统的平台可在转入目的蛋白基因的同时转入GS基因，在筛选阶段采用不含谷氨酰胺的培养基进行筛选。但由于CHO-K1细胞具有内源的GS基因，因此在筛选时往往需要添加MSX甚至和一定量的抗生素同时筛选，以提高筛选效率，而且在工业生产过程中一旦添加MSX作为细胞毒物就很难去除。此外，由于内源GS基因的存在，筛选出的高表达克隆往往稳定性较差，后期培养过程中可能会因为MSX压力的消失外源蛋白产量降低，因此需要进行充分的稳定性评估后，方可用于后期的工艺开发及规模化生产。针对于筛选问题，于2012年已有研究机构对内源性的GS等位基因进行敲除，大大提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期，同时提升了最终克隆的稳定性，经过筛选CHO-GS-KO细胞株已经在全球应用于多个产品的开发。目前猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗主要是杆状病毒源和大肠杆菌源，CN7674883A公布了猪瘟病毒E2基因重组CHO疫苗制备方法。该蛋白只含有E2序列，该E2序列经过了密码子序列优化，其转染的细胞株为CHO-K1，另外其悬浮驯化过程相对较长。同时亚单位疫苗的一个技术瓶颈就是缺乏细胞免疫，造成攻毒保护不完全。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种能够高效表达猪瘟E2-IL1蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株命名为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19193，保藏日期为2019年12月6日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。同时本专利技术设计了上述重组CHO细胞株的构建方法，构建方法包括以下步骤，(1)人工合成E2-IL-6His基因序列；(2)HindⅢ和EcoRI酶切E2-IL1-6His序列和p1020载体序列，回收酶切后的E2-IL-6His和p1020片段，连接、转化、克隆PCR及测序验证，构建p1020-E2-IL1-6His表达载体；(3)将p1020-E2-IL1-6His转染CHO-GS-KO-B40细胞株，通过培养、单克隆筛选获得高表达E2-IL1的细胞株CHO-B40-SE2S-IL1·His-131；(4)CHO-B40-E2-IL1-131细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板扩大培养，6孔板阶段能够实现完全悬浮无血清培养。进一步的，人工合成的E2-IL1-6His基因序列为不含有跨膜区的猪瘟E2序列，该E2序列后面连接了IL1中的一段序列，大小为21bp以及6his序列，该序列如SEQIDNO.1所示，该序列命名为E2-IL1-6His。本专利技术的E2-IL1-6His基因序列是将E2和IL-1序列融合表达。同时本专利技术专利还设计将上述高效表达猪瘟E2-IL1蛋白的重组CHO细胞株用于制备猪瘟E2-IL1亚单位疫苗的方法，步骤为，将重组CHO细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131经过无血清悬浮放大培养后，离心，取上清液测E2-IL1融合蛋白的含量，并与佐剂ISA206VG按1:1比例混合，得到重组猪瘟E2-IL1亚单位疫苗。经上述方法制得的猪瘟病毒E2-IL1亚单位疫苗能够应用于制备猪瘟病毒诊断试剂。相对于现有技术，本专利技术专利设计的高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株的进步之处在于，引入了IL1序列，可以更好的诱导细胞免疫；细胞株CHO-B40为敲除GS的CHO细胞株，筛选单克隆重组细胞株无需加压或者加抗生素进行筛选，且筛选的重组细胞株更加稳定；同时本专利技术在重组细胞株悬浮培养驯化过程中，扩大培养至6孔板阶段即可实现重组CHO细胞株的无血清悬浮培养，缩短筛选时间，降低成本，提高产量，更易产业化。同时本专利技术的E2-IL1蛋白的分子量在63kD左右，其糖基化更加完善，因此该E2-IL1蛋白可很好的应用于猪瘟病毒亚单位疫苗的研发中。同时用该E2-IL1融合蛋白与佐剂ISA206VG制成疫苗免疫仔猪能够同时诱导体液免疫和细胞免疫，血清学检测结果不仅能够检测到针对E2的中和抗体，同时能够在血清中检测到较高的干扰素-γ以及能够检测到较强的淋巴细胞增殖反应。本专利技术构建的E2-IL1融合蛋白的重组细胞株(CHOB40-SE2S-IL1·His-131株)不仅能够高表达E2-IL1融合蛋白，而且可以实现抗原蛋白的无血清、大规模、稳定生产。附图说明图1P1020-E2-IL1-his以及P1020-E2-6his双酶切鉴定结果，其中M为MarkerBM8000，大小依次为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-4依次为P1020-E2-IL1-his双酶切，P1020-E2-IL1-his环状质粒，P1020-E2-his双酶切，P1020-E2-his环状质粒。图2细胞株CHO-B40-E2-56不同摇瓶发酵时间蛋白表达检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa；5d-12d依次代表其培养天数。图3细胞株CHO-B40-E2-IL1-131不同摇瓶发酵时间蛋白表达检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa；5d-12d依次代表其培养天数。图4是动物试验免疫后抗体效价检测结果图5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株，其特征在于，所述重组CHO细胞株名称为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.19193。/n
【技术特征摘要】
1.一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株，其特征在于，所述重组CHO细胞株名称为CHOB40-SE2S-IL1·His-131株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.19193。
2.一种高效表达猪瘟E2-IL1融合蛋白的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，构建方法包括以下步骤，
(1)人工合成E2-IL1-6His基因序列；
(2)HindⅢ和EcoRI酶切E2-IL1-6His序列和p1020载体序列，回收酶切后的E2-IL-6His和p1020片段，连接、转化、克隆PCR及测序验证，构建p1020-E2-IL1-6His表达载体；
(3)将p1020-E2-IL1-6His转染CHO-GS-KO-B40细胞株，通过培养、单克隆筛选获得高表达E2-IL1的细胞株CHOB40-SE2S-IL1·His-131；
(4)将CHOB40-SE2S-IL1·His-131细胞株从96孔板到24孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：周佳彬，刘喜凤，刘燕，杨闯，曹玉飞，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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