高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用，属于兽用生物制品领域。本发明专利技术将鹅星状病毒的ORF2基因根据基因序列功能的不同分为两段表达，表达产物分别为衣壳蛋白capsid precursor(简称cap)和刺突蛋白capsid spike(简称spike)。根据功能区进行分割的两段蛋白可用大肠杆菌、杆状病毒和CHO表达系统进行表达。通过纯化方法获得鹅星状病毒的capsid precursor表达蛋白和capsid spike表达蛋白。表达的衣壳蛋白(capsid precursor)和刺突蛋白(capsid spike)蛋白可用于制备鹅星状病毒亚单位疫苗和卵黄抗体。本发明专利技术制备的亚单位疫苗和卵黄抗体具有很好的免疫效果和治疗效果，可应用于预防鹅星状病毒引起的疾病，并具有生产成本低、操作简单、生物安全性好的优点。

【技术实现步骤摘要】
高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用。
技术介绍
鹅星状病毒(GooseAstrovirus，GAstV)是引起三周龄以内的雏鹅，发生高致死性内脏痛风病的一种星状病毒。其发病特点是：鹅群感染GAstV后，以组织器官及腿部肌肉、关节覆盖大量尿酸盐沉淀物为主要特征，发病率达50％以上，致死率可达30％以上，对三周龄以内的雏鹅具有较强感染性。感染后康复鹅易产生免疫抑制。其主要临床症状包括精神沉郁，食欲不振，腹泻，生长不良，还可导致肝炎、肾炎等疾病。死亡雏鹅剖检可发现肾小管上皮细胞损伤，心脏、肝脏、肺脏、腿肌、胸肌等部位出现严重的尿酸盐沉积，非化脓性脑炎等特征。雏鹅早期感染GAstV出现活动减少、四肢瘫痪、精神沉郁的症状。感染GAstV的雏鹅很快即可出现死亡。感染后的雏鹅通过排粪等途径持续排毒，经粪口传播，难以控制传染源。GAstV给养禽业带来了巨大的经济损失。现有技术防控GAstV的主要方法仍然是延长空舍时间、消毒及隔离等手段，没有相关预防和治疗性产品。因此，亟需开发研制新型有效的疫苗和卵黄抗体以达到有效防治该类传染病之目的。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种能高效表达鹅星状病毒ORF2基因的方法，并利用该方法制备了一种能够有效预防鹅星状病毒感染的疫苗和卵黄抗体，为防治鹅星状病毒提供保障。首先，本专利技术设计了一种能将鹅星状病毒衣壳蛋白高效表达的方法。为能将ORF2基因表达出正确的结构，根据序列结构的功能分为两段表达，表达产物分别为astroviruscapsidprecursor(简称cap)和capsidspike(简称spike)。表达后的蛋白分别形成具有衣壳蛋白和刺突蛋白的表面免疫原性结构域。包括以下步骤，(1)ORF2基因的合成，参照鹅星状病毒株ORF2基因序列，对序列进行大肠杆菌的密码子偏嗜性优化，人工合成ORF2基因如SEQIDNO.1所示，连入载体得pUC57-ORF2；(2)克隆基因的设计及PCR扩增，将ORF2基因根据编码的蛋白的功能不同将其分为衣壳蛋白39nt～406nt和刺突蛋白394nt～665nt两段分别进行载体构建和表达；所述衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述刺突蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，核酸序列如SEQIDNO.4所示；(3)扩增片段分别连接pET28a载体，将衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段切胶后用DNA纯化回收试剂盒回收，从重组菌株DH5α(pET28a)中提取质粒pET28a，将提取的pET28a载体质粒与纯化回收的衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段均分别用BamHI和NotI进行双酶切；将回收后的pET28a质粒、衣壳蛋白DNA片段(cap)和刺突蛋白DNA片段(spike)用T4DNALigase连接质粒和片段，构建重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike；(4)重组质粒的转化，cap片段和spike片段分别与pET28a的连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化菌液涂布于固体LB琼脂平板，再将LB琼脂平板放于37℃温箱中过夜培养，待LB平板上长出单克隆菌体后，挑出单菌落活化于LB液体，取微量菌液进行PCR鉴定，余下部分菌液用于提取重组质粒进行双酶切鉴定；(5)重组菌株的构建与表达，将鉴定正确的重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，构建重组表达菌株BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)，将BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)分别活化后，按1∶100的比例接种至液体TB培养基中，置于37℃摇床培养约3h，加入IPTG至终浓度0.5mM，过夜诱导后将菌液离心，去掉TB上清，余下菌体用PBS重悬超声破碎，将超声菌体离心分离上清和沉淀，利用SDS-PAGE和WesternBlot进行可溶性分析。该序列构建方法可分别应用原核表达载体、杆状病毒表达载体和CHO细胞表达载体。进一步的，所述步骤(2)中克隆基因的设计及PCR扩增的方法为，根据核苷酸序列分别设计引物进行基因扩增，引物序列为Seg1-FCGCGGATCCCAGAAACTGCCGATGAAAGCTGAAC；Seg1-RAAAAGGAAAAGCGGCCGCGCCCTGACCAGTGGTGTTAACGTTC用于扩增368个氨基酸的衣壳蛋白；Seg2-FCGCGGATCCATGCAGGTGACCCCGAGCCT；Seg2-RAAAAGGAAAAGCGGCCGCGCTGGTTTTCAGGCTCACCGCCA用于扩增272个氨基酸的刺突蛋白；在上游引物Seg1-F和Seg2-F的5′端引入限制性酶切位点BamHI，在下游引物Seg1-R和Seg2-R的5′端引入限制性酶切位点NotI；分别以Seg1-F，Seg1-R为引物，以pUC57-ORF2为模板对衣壳蛋白的基因片段进行扩增；并以Seg2-F，Seg2-R为引物，以pUC57-ORF2为模板对刺突蛋白的基因片段进行扩增。进一步的，所述方法还包括通过Ni-NTA层析柱对蛋白进行纯化，操作步骤如下：(1)填装镍料：取10mL镍填料装填柱子中，用ddH2O缓慢流过镍柱，将20％乙醇溶液流出，反复灌柱清洗；(2)平衡镍柱：20mLBindingBuffer平衡柱子；(3)样品上样：向镍柱中分别加入10mLcap蛋白或spike蛋白，重复上样3次；(4)洗涤蛋白：50mLWashingBuffer持续洗涤杂蛋白；(5)洗脱蛋白：10mLElutionBuffer洗脱目的蛋白。重组菌株BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spke)分别能够可溶性表达cap蛋白和spike蛋白，二者分别形成鹅星状病毒的衣壳蛋白结构域和刺突蛋白结构域。同时本专利技术还设计了一种预防鹅星状病毒的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗利用纯化后的cap蛋白和spike蛋白与免疫佐剂进行配比后进行乳化制得。进一步的，所述免疫佐剂为油佐剂、铝佐剂、蜂胶佐剂、油水双相佐剂中的一种。本专利技术表达的cap和spike目的蛋白可用于鹅星状病毒抗体检测试剂盒研制、亚单位疫苗和卵黄抗体的研制，更加简易、高效和经济，具有巨大的生产应用价值。其中亚单位疫苗由表达的鹅星状病毒衣壳蛋白和刺突蛋白按照一定比例混合，经纯化后和矿物油免疫佐剂混合制得。现对于现有技术，本专利技术的进步之处在于，提供的衣壳蛋白和刺突蛋白是GAstV的主要结构蛋白之一，含有能诱导中和抗体的构象依赖性抗原决定簇，是GAstV的保护性抗原，其诱导的中和抗体能保护宿主不受GA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用，其特征在于，将鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因进行分段表达，包括以下步骤，/n(1)ORF2基因的合成，参照鹅星状病毒株ORF2基因序列，对序列进行大肠杆菌的密码子偏嗜性优化，人工合成ORF2基因，如SEQ ID NO.1所示，连入载体得pUC57-ORF2；/n(2)克隆基因的设计及PCR扩增，将ORF2基因根据编码的蛋白的功能不同将其分为衣壳蛋白39nt～406nt和刺突蛋白394nt～665nt两段分别进行载体构建和表达；所述衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述刺突蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核酸序列如SEQ ID NO.4所示；/n(3)扩增片段分别连接pET28a载体，将衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段切胶后用DNA纯化回收试剂盒回收，从重组菌株DH5α(pET28a)中提取质粒pET28a将提取的pET28a载体质粒与纯化回收的衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段均分别用BamHI和NotI进行双酶切；将回收后的pET28a质粒、衣壳蛋白DNA片段(cap)和刺突蛋白DNA片段(spike)用T4 DNALigase连接质粒和片段，构建重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike；/n(4)重组质粒的转化，cap片段和spike片段分别与pET28a的连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化菌液涂布于固体LB琼脂平板，再将LB琼脂平板放于37℃温箱中过夜培养；待LB平板上长出单克隆菌体后，挑出单菌落活化于LB液体，取微量菌液进行PCR鉴定，余下部分菌液用于提取重组质粒进行双酶切鉴定；/n(5)重组菌株的构建与表达，将鉴定正确的重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，构建重组表达菌株BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)，将BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)分别活化后，按1∶100的比例接种至液体TB培养基中，置于37℃摇床培养约3h，加入IPTG至终浓度0.5mM，过夜诱导后将菌液离心，去掉TB上清，余下菌体用PBS重悬超声破碎，将超声菌体离心分离上清和沉淀，利用SDS-PAGE和Western Blot进行可溶性分析。/n...

【技术特征摘要】
1.高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法及其应用，其特征在于，将鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因进行分段表达，包括以下步骤，
(1)ORF2基因的合成，参照鹅星状病毒株ORF2基因序列，对序列进行大肠杆菌的密码子偏嗜性优化，人工合成ORF2基因，如SEQIDNO.1所示，连入载体得pUC57-ORF2；
(2)克隆基因的设计及PCR扩增，将ORF2基因根据编码的蛋白的功能不同将其分为衣壳蛋白39nt～406nt和刺突蛋白394nt～665nt两段分别进行载体构建和表达；所述衣壳蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，核酸序列如SEQIDNO.2所示，所述刺突蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，核酸序列如SEQIDNO.4所示；
(3)扩增片段分别连接pET28a载体，将衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段切胶后用DNA纯化回收试剂盒回收，从重组菌株DH5α(pET28a)中提取质粒pET28a将提取的pET28a载体质粒与纯化回收的衣壳蛋白DNA片段和刺突蛋白DNA片段均分别用BamHI和NotI进行双酶切；将回收后的pET28a质粒、衣壳蛋白DNA片段(cap)和刺突蛋白DNA片段(spike)用T4DNALigase连接质粒和片段，构建重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike；
(4)重组质粒的转化，cap片段和spike片段分别与pET28a的连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化菌液涂布于固体LB琼脂平板，再将LB琼脂平板放于37℃温箱中过夜培养；待LB平板上长出单克隆菌体后，挑出单菌落活化于LB液体，取微量菌液进行PCR鉴定，余下部分菌液用于提取重组质粒进行双酶切鉴定；
(5)重组菌株的构建与表达，将鉴定正确的重组质粒pET28a-cap和pET28a-spike分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，构建重组表达菌株BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)，将BL21(DE3)pLysS(pET28a-cap)和BL21(DE3)pLysS(pET28a-spike)分别活化后，按1∶100的比例接种至液体TB培养基中，置于37℃摇床培养约3h，加入IPTG至终浓度0.5mM，过夜诱导后将菌液离心，去掉TB上清，余下菌体用PBS重悬超声破碎，将超声菌体离心分离上清和沉淀，利用SDS-PAGE和WesternBlot进行可溶性分析。


2.根据权利要求1所述的高效表达鹅星状病毒可溶性衣壳蛋白的ORF2基因的方法，其特征在于，所述步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌云，张博，谢田田，闫召璐，赵远菲，耿彦杰，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33