一种表达鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种表达鸡VP2和鸡GAL‑1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。本发明专利技术通过电转含有VP2‑GAL1序列的真核表达载体，经过单克隆细胞筛选，获得表达鸡传染性法氏囊病毒VP2‑GAL1融合蛋白的重组细胞株，该细胞株可实现蛋白的无血清、大规模、稳定生产；用VP2‑GAL1蛋白与白油佐剂乳化制成疫苗免疫SPF鸡后能够产生较高的针对VP2的中和抗体，且攻毒保护率提高。本发明专利技术可以应用于鸡传染性法氏囊亚单位疫苗的开发。

【技术实现步骤摘要】
一种表达鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能够高效表达鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
传染性法氏囊病(InfectiousBursalDisease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus,IBDV)引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV是目前危害世界养禽业的三大主要传染病之一，在我国被农业部列为重点防御的二类烈性传染病。IBDV对雏鸡有高度感染性，其特征是通过破坏法氏囊中的B淋巴细胞来摧毁其淋巴器官。IBDV属于双RNA病毒，主要有5种病毒蛋白，其中VP2占病毒蛋白的51％，是主要的结构蛋白，能够诱导中和抗体产生，是主要的保护性抗原。鸡的β-防御素-1(Gallinacin-1，GAL1)是禽体内发现的一种抗菌肽，主要表达在骨髓、气管、肝脏、肺脏、法氏囊及皮肤，对大肠杆菌、白色念珠菌、沙门氏菌等有抑菌作用。市场上IBDV疫苗有全病毒弱毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗。目前，弱毒活疫苗和灭活疫苗其安全性和制造工艺仍存在不足，如弱毒疫苗存在毒力返强及不同毒株基因重配的风险；灭活疫苗存在灭活不彻底，抗原制备困难等弊端。基因工程亚单位疫苗虽具有生物安全性高，操作简单，成本低等特点，但是其免疫保护率低是制约其发展的一大因素，因此提高亚单位疫苗免疫保护率成为研发重点。真核表达系统能够进行更准确的转录后修饰，保持抗原的天然结构，提高疫苗免疫原性；免疫佐剂及免疫增强剂的使用也在提高亚单位疫苗保护率方面起到关键作用。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术设计了一种鸡传染性法氏囊病毒VP2和鸡β防御素1的融合蛋白，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码该蛋白的基因序列如SEQIDNO.1所示。并设计了能够表达该鸡传染性法氏囊VP2和鸡GAL1融合蛋白的重组CHO细胞株，该细胞株为CHO-B40-VP2-GAL1-80#株，同时本专利技术细胞株以CHO-B40-VP2-80#命名保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议分类命名为中国仓鼠卵细胞，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNo.19959。同时本专利技术设计了上述重组CHO细胞株的构建方法，构建方法包括以下步骤，(1)人工合成如SEQIDNO.1所示的基因序列VP2-GAL1，该序列含有临床分离的鸡IBDV流行毒株VP2蛋白的基因序列和鸡β-防御素-1的成熟蛋白基因GAL-1序列，两段序列间用一个短的linker连接，VP2-GAL1序列两端分别设有HindⅢ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点；(2)使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切上述VP2-GAL1序列和p1020载体，回收酶切后的VP2-GAL1序列和p1020载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建p1020-VP2-GAL1表达载体；(3)使用p1020-VP2-GAL1表达载体转染CHO-GS-KO-B40细胞株，CHO-GS-KO细胞为内源性GS等位基因敲除细胞株，通过细胞培养、单克隆筛选获得高表达VP2-GAL1融合蛋白的细胞株CHO-B40-VP2-GAL1-80#；(4)将CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株从96孔板到24孔板再到6孔板进行扩大培养，驯化3代，得到能够完全悬浮无血清培养的细胞株。同时本专利技术专利还设计将上述CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株高效表达的VP2-GAL1融合蛋白用于制备IBDV亚单位疫苗的方法，步骤为，将重组CHO细胞株CHO-B40-VP2-GAL-1-80#经过无血清悬浮放大培养后，离心，收集细胞沉淀，用PBS溶解。测VP2蛋白琼扩效价，并与白油佐剂按1:2比例混合，得到鸡传染性法氏囊VP2-GAL1亚单位疫苗。所述VP2-GAL1融合蛋白琼扩效价为1:8～1:32，优选的，琼扩效价为1:16。经上述方法制得的IBDVVP2-GAL1亚单位疫苗用来预防鸡传染性法氏囊病毒引起的相关疾病。相对于现有技术，本专利技术专利的进步之处在于，选用的CHO细胞株为哺乳动物细胞株CHO-GS-KO，CHO-GS-KO细胞为内源性GS等位基因敲除细胞株，该细胞株在筛选克隆过程中无需添加抗生素或者MSX，提高了筛选效率，缩短了稳定细胞株的开发周期，同时提升了细胞株的稳定性；获得的CHO-B40-VP2-GAL1-80#细胞株能够高效表达鸡VP2-GAL1融合蛋白；利用该融合蛋白制备的疫苗经皮下注射后，疫苗注射SPF鸡产生较高的中和抗体，对IBDV强毒BC6-85攻击具有坚强的抵抗力，免疫保护率提高。附图说明图1质粒P1020-VP2-GAL1双酶切鉴定结果，其中M为MarkerBM8000，大小依次为8000bp，5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道1-2依次为P1020-VP2-GAL1双酶切，P1020-VP2-GAL1环状质粒。图2VP2蛋白和VP2-GAL1融合蛋白WB检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa。泳道1-3为VP2蛋白检测结果，泳道4-6为VP2-GAL1融合蛋白检测结果，一抗为VP2单抗。图3VP2-GAL1抗原琼扩效价检测结果。图4VP2抗原琼扩效价检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的说明，本专利技术的实施例仅用于说明本专利技术的技术方案，并非限定本专利技术。本专利技术实施列中所使用的试剂均为市售产品。本专利技术试剂、菌株和质粒来源名单如下：本专利技术所用CHO-GS-KO-B40细胞及真核表达载体P1020由沈阳药科大学马宁宁实验室提供；细胞培养基均购自壹生科(深圳)有限公司；白油佐剂购自于河南通商进出口有限公司；96孔细胞培养板购自康宁公司；鸡传染性法氏囊抗体购自山东绿都生物技术有限公司；EasyPfuDNA聚合酶、dNTP以及核酸电泳Marker购于全式金生物技术公司；感受态细胞DH5α购自于博迈德生物技术有限公司；质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和细胞裂解液购自天根生化公司；T4DNA连接酶和各种限制性内切酶购自NEB公司；IBDV标准血清和抗原以及IBDV强毒BC6-85株购自中国兽用药品监察所；VP2-GAL1基因由六合华大基因公司进行合成。实施例一构建表达载体p1020-VP2-GAL11.VP2-GAL1序列合成以临床分离的鸡法氏囊流行毒株基因组为模板，扩增VP2序列，两端带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切，进行测序。根据VP2测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该蛋白的基因序列为VP2-GAL1序列,如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为VP2-GAL1融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，编码该蛋白的基因序列为VP2-GAL1序列,如SEQIDNO.1所示。


2.一种表达权利要求1所述的鸡VP2和鸡GAL-1融合蛋白的重组CHO细胞株，其特征在于，所述重组CHO细胞株为CHO-B40-VP2-GAL1-80#株，该细胞株保藏名称为CHO-B40-VP2-80#，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19959。


3.一种如权利要求2所述的重组CHO细胞株的构建方法，其特征在于，构建方法包括以下步骤；
(1)人工合成基因序列VP2-GAL1，该序列含有临床分离的鸡IBDV流行毒株VP2蛋白的基因序列和鸡β-防御素-1的成熟蛋白基因GAL-1序列，两段序列间用一个短的linker连接，VP2-GAL1序列两端分别设有HindⅢ酶切位点和EcoRⅠ酶切位点；
(2)使用HindⅢ和EcoRⅠ酶切上述VP2-GAL1序列和p1020载体，回收酶切后的VP2-GAL1序列和p1020载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建p1020-VP2-GAL1表达载体；
(3)使用p1020-VP2-GAL1表达载体转染CHO-GS-KO...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘喜凤，周佳彬，曹玉飞，杨闯，刘燕，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33