一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用。所述人鼠卵透明带融合蛋白，由人类卵透明带肽段和小鼠卵透明带肽段组成，兼有两个物种的卵透明带蛋白，可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。

【技术实现步骤摘要】
一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，涉及一种人鼠卵透明带融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
透明带是卵细胞外的一层细胞外壳，在卵子发育和受精中有重要作用，是受精研究的重要靶标分子，是发展避孕疫苗的候选抗原。因此抗透明带抗体是受精和发育研究中的重要工具。但由于天然来源很有限，传统制备抗透明带抗体的方法受到很大的制约，现在制备抗体主要通过基因表达获得透明带抗原，由于透明带分子结构的特殊性，给透明带的制备带来一些实际困难，因此目前市场上的抗透明带抗体较昂贵。透明带是高度特异的蛋白质，既有组织特异性，分布于卵巢组织中，又有种族特异性，不同种动物的透明带有免疫特异性。因此要分别制备各自的抗体，然而目前抗体造价较高。由于人类透明带和小鼠透明带是当今实验研究使用很多的实验材料，不同物种间的卵透明带有明显的种族特异性。实际上，不同动物的研究在不同体系中进行，用于不同动物的抗透明带抗体在不同的研究体系不存在干扰现象，而实验研究中，往往不会几物种材料同时做实验，尤其是人源实验材料不会与其它动物来源的实验材料同时安排在一个实验体系里，不涉及不同物种间的抗透明带抗体的交叉干扰。但是目前，关于人类透明带和小鼠透明带抗体的制备均是先各自分别制备不同的透明带抗原，再免疫分别制备各自的抗体，例如：乜春城等(2011)制备了小鼠ZP2肽(乜春城，禹艳红，谢妍，曹佐武.小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建.暨南大学学报(医学版)2011,32(4):374～378))，曹佐武等(2013)制备了人ZP3肽(曹佐武，徐放，谢琪璇，乜春城，姚冠颖。人ZP3的N端肽的体外表达.暨南大学学报(医学版)2013，34(6)：583-587)；不仅费时费力，且成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种人鼠卵透明带融合蛋白。本专利技术的另一目的在于提供所述人鼠卵透明带融合蛋白的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述人鼠卵透明带融合蛋白的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种人鼠卵透明带融合蛋白，由人卵透明带蛋白成分和小鼠透明带蛋白成分组成。本专利技术设计了一种融合蛋白，由人类的卵透明带蛋白成分和小鼠的透明带蛋白成分组成，兼有两个物种的卵透明带蛋白。由于卵透明带蛋白是多表位的大分子，包含有许多抗原决定簇，许多不同的片段都可以诱发抗体，因此可以选用人类的卵透明带蛋白和小鼠的透明带蛋白中不同的肽段组成融合蛋白，以诱发产生两种不同的特异性抗体。可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。具体地，所述人鼠卵透明带融合蛋白由人卵透明带蛋白中具有抗原表位的肽段和小鼠透明带蛋白中具有抗原表位的肽段。本专利技术对融合蛋白中的人或鼠的卵透明带肽段的序列不做任何限定，任何可以诱发动物机体产生抗体的人或鼠的卵透明带蛋白中的肽段均在本专利技术保护范围内。透明带有ZP1，ZP2，ZP3三种成分组成，其中ZP2和ZP3是较重要的成分。优选地，本专利技术提供一种人鼠卵透明带融合蛋白，包含hZP323～231肽段和mZP2192～505肽段，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。由人透明带3肽成分和小鼠透明带2肽成分组成，是由hZP3+mZP2，两种不同物种和不同类型透明带蛋白搭配的融合蛋白。优选地，编码SEQIDNO：1所示融合蛋白的融合基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以通过基因重组技术制备编码人卵透明带肽段和小鼠卵透明带肽段的DNA序列或人工合成。优选地，所述融合蛋白的C端连接有6×His标签肽，用于纯化融合蛋白。本专利技术还提供所述融合蛋白的制备方法，先构建体外表达所述融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白；或直接人工合成目标融合蛋白序列。优选地，所述包含hZP323～231肽段和mZP2192～505肽段的融合蛋白是将pGEM-hZP3载体上的编码人ZP3的23～231肽段的DNA插入到pET-mZP2表达载体多克隆位点N端的BamHI和EcoRI位点之间，构建表达hZP323～231肽和mZP2192～505融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白。进一优选地，所述表达载体为pET原核表达载体。进一优选地，所述宿主菌为大肠杆菌。进一优选地，所述诱导表达为将宿主菌于35～37℃培养至OD600达0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.8～1.2mmol/L，诱导表达6～10h。本专利技术还提供所述人鼠卵透明带融合蛋白在制备抗人卵透明带抗体和/或抗小鼠卵透明带的抗体中的应用。具体地，所述应用为将所述融合蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物机体，取血分离血清。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术设计了同时含有人透明带成分和小鼠透明带成分的融合蛋白，可以表达产生人透明带和小鼠透明带的融合蛋白，可以一次性表达、一次性免疫、一次性分离制备抗人透明带和小鼠透明带的两种抗体，用于人类和小鼠两类常用材料的实验，节省人力物力，又不影响实验效果。附图说明图1为pET-hZP3mZP2重组质粒的图谱。图2为表达产物的SDS-PAGE电泳图。图3为抗血清与小鼠卵巢切片反应，右图表示Cy3荧光标记抗体与小鼠卵透明带特异结合(红色箭头所指)，左图为白光照片，说明血清含有抗小鼠透明带抗体。图4为用抗血清与人卵进行免疫细胞化学实验，FITC荧光标记抗体能与卵细胞外的透明带特异结合(左图)，说明抗血清含有抗人透明带抗体。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。大肠杆菌E.coliDH5α、Rosetta-gami(DE3)pLysS菌株、载体pET21b实施例1hZP3和mZP2融合蛋白的制备1、制备hZP3和mZP2嵌合肽的重组基因(1)制备pET-mZP2质粒该质粒是pET改造的mZP2的表达载体(见参考文献1：乜春城，禹艳红，谢妍，曹佐武.小鼠ZP2肽的基因克隆和原核表达载体的构建.暨南大学学报(医学版)2011,32(4):374～378)。mZP2肽段为小鼠ZP2编码DNA的604～1545片段，插入在多克隆位点的EcoRI和XhoI位点之间，可编码mZP2中段的192～505肽，后带有6XHis标签肽的DNA序列，上游备有一个BamHI位点。----BamHI-EcoRI--XhoI----DNA序列如下：ATGGGTCGGGATCCGAATTCACCCTTGAA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人鼠卵透明带融合蛋白，其特征在于，由人类卵透明带蛋白成分和小鼠的透明带蛋白成分组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种人鼠卵透明带融合蛋白，其特征在于，由人类卵透明带蛋白成分和小鼠的透明带蛋白成分组成。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包含hZP323～231肽段和mZP2192～505肽段，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，编码SEQIDNO：1所示融合蛋白的融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。


4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的C端连接有6×His标签肽。


5.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，先构建体外表达所述融合蛋白的表达载体，再转化宿主菌，诱导表达产生融合蛋白。


6.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，将pGEM-hZP3载体上的编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹佐武，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44