一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法，属于生物技术及兽用生物制品技术领域。所述CHO细胞株中插入了EP153R蛋白的核酸序列，其基因序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术设计的非洲猪瘟EP153R蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

A CHO cell line with high expression of ep153r protein of African swine fever and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法
本专利技术属于生物技术及兽用生物制品
，具体涉及一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法和应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)，是由非洲猪瘟病毒ASFV引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此我国将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病之一。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年8月2日，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市疑似发生中国第一例非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成严重威胁，带来了巨大的经济损失，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。非洲猪瘟(ASF)的病原是非洲猪瘟病毒(ASFV)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。ASFV主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正二十面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白；可根据p72和CD2V分别进行基因型和血清型分析。其中EP153R基因全长474bp，编码含有153～163个氨基酸的凝集素类膜蛋白，与一些C型凝集素分子的N-端结构域具有同源性，包含N-糖基化位点、磷酸化作用位点、酰化作用位点、中央跨膜区、C型动物凝集结构域(C-typelectin)、细胞附着序列。EP153R在病毒感染期间的早期和晚期均表达，为病毒在细胞增殖的非必需蛋白。EP153R是非洲猪瘟蛋白中仅有的糖基化蛋白之一，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。据报道，EP153R基因可诱导或保持病毒CD2同源物与其相应受体的结合；EP153R蛋白为多功能蛋白，C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用，能够调控细胞凋亡，且参与ASFV感染细胞后的血细胞吸附过程。EP153R基因的存在使病毒感染或星形孢菌素处理Vero细胞中P53蛋白的转录活性降低，是第一个描述具有抗凋亡特性的C型动物凝集素。EP153R是和ASFV外膜蛋白CD2V相连的膜蛋白，参与了CD2V的血吸附，EP153R和CD2V具有保护抗原性。EP153R抑制宿主细胞p53的反式活性，降低p53下游凋亡因子的产生，从而抑制细胞凋亡。抑制MHCI类分子的表达，主要通过抑制MHC-I从内质网到细胞膜的胞外分泌过程，而不是影响MHC-I的表达及成熟过程，达到免疫逃逸的目的。缺失EP153R后病毒在细胞中的增殖不受到影响，但ASFV感染细胞所导致的血细胞吸附现象基本消失。目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，对防御非洲猪瘟具有重大意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种能够在CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞中高效表达的非洲猪瘟EP153R蛋白，针对CHO细胞株偏爱的密码子优化后，其核酸序列如SEQIDNo.1所示，蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。同时，本专利技术将上述优化后的EP153R蛋白的基因序列插入到了传统CHO细胞株中，构建了能够高效表达该非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株，该细胞株命名为CHO-EP153R，分类命名为中国仓鼠卵巢细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月6日，保藏号为CGMCCNo.18850。该高效表达该非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株的构建方法是基于电穿孔法使用上述经优化后EPR153R蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。其中重组质粒转染宿主CHO细胞株的步骤为：A、培养基准备：配制含10％dFBS的CSC-03单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照6000cells/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基CD-pro清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；C、取200μgEP153R蛋白的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，静置2min开始电转，并记录电转时长及电压；F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％dFBS的单克隆培养基中，吹吸混匀；G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。转染完成的CHO细胞株的筛选的方法为：将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加蛋氨酸亚氨基代砜进行处理；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO2条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增加料，细胞活率60％左右时，收集上清，纯化，再进一步筛选得到最佳的已插入EP153R蛋白的CHO细胞株。同时本专利技术设计了上述非洲猪瘟EP153R蛋白在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用以及其在制备非洲猪瘟亚单位疫苗中的应用。本专利技术的表达非洲猪瘟EP153R蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。本专利技术以NCBI官网记录本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟EP153R蛋白，其特征在于，所述的EP153R蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，其基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟EP153R蛋白，其特征在于，所述的EP153R蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，其基因的核酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株，其特征在于，所述CHO细胞株中插入了权利要求1所述的非洲猪瘟EP153R蛋白的核酸序列，该细胞株命名为CHO-EP153R，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月6日，保藏号为CGMCCNo.18850。


3.如权利要求2所述高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用权利要求1所述EPR153R蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。


4.根据权利要求3所述的高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，重组质粒转染宿主CHO细胞株包括以下步骤，
A、培养基准备：配制含10％dFBS的CSC-03单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；
B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照6000cells/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基CD-pro清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL电转培养基将细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋春雨，兰青，陈小娟，侯野，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33