猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒。该方法是通过用已知量的猪瘟病毒与不同稀释度的待检猪血清进行中和，中和后接种ST细胞，培养2‑5天，通过间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价(中和结果)，从而间接获得猪血清中和抗体的效价。本发明专利技术检测时间短、操作简单、成本低廉、结果准确特异，能真实反映免疫猪群的中和抗体水平，可用于疫苗免疫程序的制定、鉴别疫苗的质量、监测猪群的免疫状态等，应用广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，特别是涉及一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法及检测试剂盒。
技术介绍
猪瘟(Classicalswinefever，CFS)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一种急性、热性高度接触性传染病，主要临床症状有：稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点。猪瘟病毒主要通过呼吸道和消化道传染，传播速度快，发病率和病死率高，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。猪瘟是严重危害全球养猪业的重要传染病,是世界动物卫生组织(OIE)疫病目录所列的必须通报的疫病之一。近年来,我国猪瘟时有发生,主要表现为隐性带毒和慢性感染,成为影响养猪业发展的一大隐患。对猪瘟的成功控制主要依赖于疫苗免疫。因此，疫苗免疫效果的优劣对猪瘟的防控起到了决定性作用。猪瘟抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，另外，猪瘟抗体水平检测对于猪瘟疫苗免疫程序的制定也具有重要意义。目前，猪瘟抗体水平的检测方法主要有间接血凝试验、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、病毒中和试验等。间接血凝试验主观性强，检测效率低，不适合大批量检测。液相阻断ELISA检测方法操作简便、方法敏感、检测样本量大，但由于自身的弊端，容易出现非特异性反应，且检测成本高。病毒中和试验以测定病毒感染力为基础，以病毒与血清中和后的感染力为依据，从而判断血清中抗体消长情况及抗体对病毒的中和能力。病毒中和实验结果准确特异，能真实反映猪群的免疫抗体水平。国内常规使用中和兔体试验，但实验中一些不可控制的动物因素，如动物间个体差异等可能造成结果的变化，且操作时所需人力物力成本较高，且对操作人员的专业技能要求较高，在实际应用中不易操作。而国际上采用的中和免疫荧光试验，由于采用了猪瘟病毒强毒株作为试验毒株，由于其容易散毒且不易获得等因素，使其推广应用也受到了限制。因此，迫切需要一种猪血清中猪瘟中和抗体的定量检测方法及检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法。本专利技术所提供的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，先将已知滴度的猪瘟兔化弱毒细胞毒和不同稀释度的灭活猪血清混合进行中和反应，再将中和后毒液感染已知细胞浓度的ST细胞悬液，最后，以猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2MonoclionalAntibody为一抗，以过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价。在上述猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法中，所述用于作中和毒的猪瘟兔化弱毒细胞毒稀释至200TCID50，同时以100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒为回归对照；所述灭活猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；所述猪瘟兔化弱毒细胞毒与灭活猪血清的混合比例为1:1；所述ST细胞悬液的细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL，中和液与ST细胞悬液的混合比例为1:1。所述用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价的方法包括以下步骤：a.洗板；b.用冷丙酮固定细胞，洗板；c.用过氧化氢溶液去除细胞源性的过氧化酶，洗板；d.加入猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2MonoclionalAntibody(一抗)，孵育，使ST细胞质内猪瘟病毒与一抗特异结合，洗板；e.加入用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，孵育，使二抗与一抗特异结合，洗板；f.加入显色液显色，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：被感染细胞胞质呈现红色，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性；g.根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。具体来讲，本专利技术所提供的猪血清中猪瘟中和抗体的定量检测方法，可包括以下步骤：1)待检猪血清灭活：将无菌采集的待检猪血清置55-57℃水浴灭活30-40min；2)猪血清稀释：在细胞培养板各孔中加入50μLMEM培养液，随后在第一孔中加入待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL，再加入第三孔中，以此类推，直至最后一孔(将混合液弃去50μL)，猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，以此类推，每个不同稀释度待检猪血清设2-4个平行孔；3)中和毒稀释：将猪瘟兔化弱毒细胞毒用MEM培养液稀释至200TCID50/100μL，再将稀释后的猪瘟兔化弱毒细胞毒进行2倍、20倍、200倍、2000倍稀释，得到100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒；4)血清中和：按每孔50μL将200TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到步骤2)含不同稀释度猪血清的孔中，将猪血清与猪瘟兔化弱毒细胞毒37℃中和1h；同时设病毒回归对照，按每孔100μL将100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒加入空白孔中，每个稀释度设4-8个平行孔；5)制备ST细胞悬液及培养ST细胞：将长满单层的猪睾丸(SwineTestis，ST)细胞用EDTA-胰蛋白酶消化分散，得到细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL的ST细胞悬液，将ST细胞悬液按每孔100μL加入步骤4)中的细胞培养板中，将细胞培养板放入恒温二氧化碳培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养48h-120h；6)用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价，具体过程如下：6.1将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养孔内的液体，用PBS洗涤；6.2每孔加入100μL80％、-20℃冷丙酮4℃固定10-30min，弃去丙酮溶液，用PBS洗涤；6.3每孔加入100μL0.1％过氧化氢溶液，室温作用20-30min；6.4加入用PBS稀释100-800倍(浓度为1.25-10μg/mL)的猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2MonoclionalAntibody(一抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去一抗，用PBS洗涤；6.5加入用PBS稀释300-1000倍(浓度为1-3/μg/mL)的用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，每孔50μL，37℃孵育1h，弃去二抗，用PBS洗涤；6.6加入显色液室温显色10-20min，弃去显色液，PBS洗涤，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：被感染细胞胞质呈现红色，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性。6.7根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价：根据Karb本文档来自技高网...

【技术保护点】
猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，先将已知滴度的猪瘟兔化弱毒细胞毒和不同稀释度的灭活猪血清混合进行中和反应，中和后病毒液与已知细胞浓度的ST细胞悬液混合，未被中和的猪瘟病毒会感染ST细胞并且繁殖，最后，以猪瘟单克隆抗体Anti‑CSFV E2Monoclional Antibody为一抗，以过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价。

【技术特征摘要】
1.猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，是以猪瘟兔化弱毒细胞毒为中和毒株，先将已知滴度的猪瘟兔化弱毒细胞毒和不同稀释度的灭活猪血清混合进行中和反应，中和后病毒液与已知细胞浓度的ST细胞悬液混合，未被中和的猪瘟病毒会感染ST细胞并且繁殖，最后，以猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2MonoclionalAntibody为一抗，以过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价。2.根据权利要求1所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述用作中和毒的猪瘟兔化弱毒细胞毒稀释至200TCID50/100μL，同时以100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒为回归对照；所述灭活猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64；所述猪瘟兔化弱毒细胞毒与灭活猪血清的混合比例为1:1；所述ST细胞悬液的细胞密度为0.2-0.4×106个ST细胞/mL，中和液与ST细胞悬液的混合比例为1:1。3.根据权利要求1或2所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：所述用间接免疫过氧化物酶法和Karber法定量检测猪血清中猪瘟中和抗体效价的方法，包括以下步骤：a.洗板；b.用冷丙酮固定细胞，洗板；c.用过氧化氢溶液去除细胞源性的过氧化酶，洗板，；d.加入猪瘟单克隆抗体Anti-CSFVE2MonoclionalAntibody(一抗)，孵育，使ST细胞质中的猪瘟病毒与一抗特异结合，洗板；e.加入用过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，孵育，使二抗与一抗特异结合，洗板；f.加入显色液显色，用显微镜观察显色结果，显色结果判定方法：细胞胞质呈现红色(被染色)，核质分明，且呈斑块状，记为阳性；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性；g.根据显色结果用Karber方法计算猪血清中猪瘟中和抗体效价的具体方法为：根据Karber计算公式logTCID50＝L-d(s-0.5)，其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差，s为阳性孔(被中和孔)比例总和；100TCID50各孔均为阳性，0.1TCID50各孔均为阴性，说明中和毒稀释准确，判定结果有效，否则结果无效。4.根据权利要求3所述的猪血清中猪瘟中和抗体效价的定量检测方法，其特征在于：具体的检测方法，包括以下步骤：1)待检猪血清灭活：将无菌采集的待检猪血清置55-57℃水浴灭活30-40min；2)猪血清稀释：在细胞培养板各孔中加入50μLMEM培养液，随后在第一孔中加入待检猪血清50μL混合后，用微量移液器取出50μL，加到第二孔中，混匀后取出50μL，再加入第三孔中，以此类推，直至最后一孔(将混合液弃去50μL)，猪血清稀释度依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每个不同稀释度待检猪血清设2-4个平行孔；3)中和毒稀释：将猪瘟兔化弱毒细胞毒用MEM培养液稀释至200TCID50/100μL，再将稀释后的猪瘟兔化弱毒细胞毒进行2倍、20倍、200倍、2000倍稀释，得到100TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒，每个稀释度设4-8个平行孔；4)血清中和：按每孔50μL将200TCID50、10TCID50、1TCID50、0.1TCID50猪瘟兔化弱毒细胞毒分别加到步...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔彩平，刘国英，范秀丽，郝鹏，纪燕，温谢，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15