人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′(PCV2 Rep′)蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用。该PCV2 Rep′蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；用该PCV2 Rep′蛋白包被ELISA酶标板，构建成能够检测PCV2自然感染猪或PCV2全病毒灭活疫苗免疫猪体内抗体的间接ELISA(iELISA)检测试剂盒。该试剂盒结合PCV2 Cap蛋白抗体iELISA试剂盒一起使用，就能区分自然感染PCV2病毒的猪的血清抗体(或免疫PCV2全病毒灭活疫苗后的猪血清抗体)，与接种PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗免疫猪的血清抗体。

Artificial modified kit for detection of porcine circovirus type 2 Rep \u2032 protein and ELISA and its application

【技术实现步骤摘要】
人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)分为PCV1，PCV2和PCV3三种血清型。PCV1不引起临床症状；PCV2被证明是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原，此外，PCV2还与猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍及增生性坏死性肺炎(PNP)、呼吸道疾病综合征(PRDC)等疾病有关，统称为猪圆环病毒病(PCVD)。PCV2能够破坏猪体免疫系统，造成免疫抑制，诱发多种病原混合感染或继发感染。PCV3是2015年6月在美国北卡罗来纳州被发现的，该病毒与圆环病毒科病毒有类似的基因组结构，但与其他圆环病毒衣壳蛋白氨基酸序列的同源性仅为45％左右，根据国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，将其归类为一种新型圆环病毒，命名为PCV3。此类病毒对猪也有一定的致病性，但到目前为止未造成养猪业的重大损失。目前，PCV2是我国流行和危害最严重的猪圆环病毒，PCV2的防控以疫苗免疫为主，PCV2基因工程亚单位疫苗是一类十分安全有效的疫苗类型。由于PCV2的流行广泛，猪体内圆环病毒抗体普遍存在，区分疫苗免疫猪和自然感染猪十分困难。PCV2病毒粒子为无囊膜的二十面体对称结构，直径为17nm。PCV2的基因组为小的环状单链DNA，在PCV2的基因组中，具有两个主要的开放阅读框，ORF1和ORF2。ORF1属Rep基因，是PCV2中的最大的开放阅读框，位于病毒基因组的正链上，编码复制相关蛋白(Rep和Rep′)，大小分别为35.7kDa和20.4kDa，Rep基因在所有的圆环病毒中都是高度保守的。PCV2Cap蛋白是病毒的结构蛋白，具有免疫保护性，是研制亚单位疫苗的靶抗原。目前，以重组杆状病毒系统和重组大肠杆菌系统表达的PCV2Cap蛋白，在基因工程亚单位疫苗中广泛使用。因此，建立一种灵敏的诊断试剂盒，用来区分亚单位疫苗免疫抗体和自然感染抗体，对于PCV2流行病学监测和疫苗免疫效果评估等，都有较重要的作用。疫苗免疫猪血清抗体检测是一种重要的免疫效果的评价方法，国内外已有许多检测猪血清PCV2抗体的ELISA检测方法。这些ELISA检测方法都是用重组表达的PCV2Cap蛋白作为间接ELISA包被抗原。天然PCV2病毒感染和PCV2基因工程亚单位疫苗(Subunitvaccine，又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并以基因产物—蛋白质或多肽制成疫苗。)免疫都会出现抗体阳性的检测结果。不能区分疫苗免疫猪和自然感染猪。不利于将养殖场里的已经感染猪圆环病毒2型的猪清除或淘汰，导致该病毒在养殖场长期传播，不能达到猪场PCV2病毒净化的目标。本专利技术人在2018年提交的申请号为“201811394114.3”，名称为“重组猪圆环病毒2型Rep蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用”的专利申请为解决上述技术问题提出了解决方案：首先制备得到重组猪圆环病毒2型Rep蛋白，重组PCV2Rep蛋白分子量约为39kD，经过一次变性亲和层析的纯化后蛋白纯度在95％以上；然后以PCV2Rep重组蛋白为包被抗原对样本血清进行间接ELISA检测，该方法检测PCV2自然感染猪或PCV2全病毒灭活疫苗(或弱毒活疫苗)免疫猪血清，会出现阳性的检测结果；而检测PCV2cap蛋白亚单位疫苗免疫猪血清则出现阴性结果。因此，用该项专利技术的PCV2Rep蛋白抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法，结合PCV2Cap蛋白包被抗原的间接ELISA检测方法，就可以区分PCV2的自然感染抗体(或全病毒疫苗免疫猪抗体)与亚单位疫苗免疫抗体，为猪场中猪圆环病毒的净化提供依据。然而该技术方案的重组猪圆环病毒2型Rep蛋白简称为PCV2Rep蛋白主要是包涵体为不可溶蛋白，因而分离纯化步骤较繁琐，而且检测的灵敏度也相对较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白及其应用。所述的人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白命名为PCV2Rep′蛋白，本专利技术用overlappingPCR的方法对PCV2Rep基因进行了人工拼接，构建了PCV2Rep′蛋白编码基因，并插入大肠杆菌表达质粒中获得工程菌E.coliBL21/pET28aPCV2Rep′M1，进行表达纯化后获得了可溶性PCV2Rep′蛋白；更有利于它的纯化和酶标板的制备，是更优的非结构蛋白iELISA检测方法。用该PCV2Rep′蛋白间接ELISA(iELISA)检测试剂盒结合PCV2Cap蛋白抗体iELISA试剂盒一起使用，就能区分自然感染PCV2病毒的猪的血清抗体(或免疫PCV2全病毒灭活疫苗后的猪血清抗体)，与免疫PCV2Cap蛋白亚单位疫苗免疫猪的血清抗体。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一，在于提供一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白，简称PCV2Rep′，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的目的之二，在于提供人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白的制备方法，所述方法包括：构建表达区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基因工程菌，然后经诱导表达与纯化即得。具体地，所述方法包括如下步骤：步骤1、构建人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达工程菌：S1、以pET28aPCV2RepM2质粒为模板，以如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示序列为引物，经PCR扩增得到产物片段A；S2、以pET28aPCV2RepM2质粒为模板，以如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示序列为引物，经PCR扩增得到产物片段B；S3、以所述片段A和片段B的混合物为模板，以如SEQIDNO.3和SEQIDNO.6所示序列为引物，经PCR扩增得到PCR产物；S4、将上述PCR产物进行胶回收后与pTopo-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α并挑取单克隆，菌液PCR鉴定后提质粒，与pET28a同时用BamHI/XhoI双酶切，连接、转化大肠杆菌BL21，菌液PCR鉴定，阳性克隆的工程菌命名为：E.coliBL21/pET28aPCV2Rep′M1；步骤2、将所得阳性克隆的工程菌进行人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白的诱导表达及纯化。本专利技术的目的之三，在于提供一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达载体，所述表达载体表达区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的目的之四，在于提供一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达工程菌，该工程菌包含所述的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达载体。优选地，所述人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达工程菌为E.coliBL21/pET28aPCV2Rep′M1。本专利技术的目的之五在于提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白，其特征在于，所述的人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白简称PCV2 Rep′，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白，其特征在于，所述的人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白简称PCV2Rep′，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：构建表达区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的基因工程菌，然后经诱导表达与纯化即得。


3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、构建人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白表达工程菌：
S1、以pET28aPCV2RepM2质粒为模板，以如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示序列为引物，经PCR扩增得到产物片段A；
S2、以pET28aPCV2RepM2质粒为模板，以如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示序列为引物，经PCR扩增得到产物片段B；
S3、以所述片段A和片段B的混合物为模板，以如SEQIDNO.3和SEQIDNO.6所示序列为引物，经PCR扩增得到PCR产物；
S4、将上述PCR产物进行胶回收后与pTopo-T载体连接，转化大肠杆菌并挑取单克隆，菌液PCR鉴定后提质粒，与pET28a同时用BamHI/XhoI双酶切，连接、转化大肠杆菌，菌液PCR鉴定，阳性克隆的工程菌命名为：E.coliBL21/pET28aPCV2Rep′M1；
步骤2、将所得阳性克隆的工程菌进行人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白的诱导表达及纯化。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中诱导表达所用的诱导剂为α-乳糖，所述诱导剂的工作浓度为0.03mol/L。


5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中纯化步骤为：诱导完毕后收集表达菌并用pH7.4，0.05MPBS重悬菌体，超声破碎得到破菌液；将所述破菌液上清用0.22μm滤膜过滤，上样至Ni柱，用含20mM咪唑的0.05mol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：荣俊，陈清清，徐保娟，李国攀，蔡联燊，匡红艳，
申请(专利权)人：长江大学，青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42