一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药基因工程与免疫学领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用。本发明专利技术提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，是通过对非洲猪瘟CD2v蛋白核酸序列进行优化合成，构建含ASFV‑CD2v基因的重组慢病毒载体，然后包装慢病毒并感染HEK‑293T细胞，再经筛选获得的。本发明专利技术提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好，易于大量生产。

A cell line expressing cd2v protein of African swine fever virus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用
本专利技术属于生物医药基因工程与免疫学领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，其临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血等，致死率可高达100％。该病一开始主要是在非洲流行，近年来逐渐扩散到欧洲及亚洲等国家和地区，我国2018年开始出现首例病猪后，在短短数月内，辽宁、河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林等省份都相继报道，感染猪死亡率接近100％，给我国养猪业造成了巨大损失。我国已将此病规定为一类动物疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报类动物疫病，该病已受到世界各国的高度重视。ASFV病毒粒子是由核壳蛋白包裹的病毒基因组DNA、病毒内囊膜、病毒衣壳和外囊膜组成的二十面体结构，直径约200nm。囊膜蛋白是构成病毒颗粒的主要结构蛋白，也是重要的表面抗原，与宿主细胞嗜性、致病性与免疫原性密切相关。已知功能的ASFV囊膜蛋白主要有CD2v、p54、p12、p30、p17和p22等。由于ASF的高致死性和高传染性，且暂时没有有效的疫苗，为防止疫病的传播，需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。目前，ASF的实验室诊断包括动物接种、病毒分离、病毒核酸DNA检测和特异性抗体检测等方法。然而，动物接种、病毒分离和病毒核酸DNA等检测方法或需要在生物安全三级以上的实验室，或需要专业的仪器设备和技术人员，或操作繁琐，难以满足基层检疫部门的需要。因此，利用重组ASFV抗原建立快速、安全的诊断和检疫方法是十分必要的。近年来，随着ASFV全基因组测序的完成，国内外学者利用基因工程技术表达了部分ASFV重要的结构蛋白(如P30、P54、P72和CD2v等)，并利用表达的重组蛋白用于ASFV血清学诊断用抗原的研究。中国专利申请CN110269932A公开了一种非洲猪瘟疫苗及其用途，并具体公开了一种免疫原性组合物，包含第一、第二和第三构建体，该组合物可以用于制备ASFV疫苗或用于治疗或预防ASFV感染的药物，这种疫苗在一定程度上降低了养猪过程中感染非洲猪瘟病毒的风险，解决了我国没有非洲猪瘟疫苗的难题。但是，这种疫苗制备过程极其复杂，对应抗原产量低，最终导致对非洲猪瘟的抑制性不高。综上可知，现有技术中普遍存在抗原产量低，检测方法复杂，对非洲猪瘟的抑制性差等问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用。本专利技术提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，且相应蛋白抗原表达量高。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。MIILIFLIFSNIVLSIDYWVSFNKTIILDSNITNDNNDINGVSWNFFNNSFNTLATCGKAGNFCECSNYSTSIYNITNNCSLTIFPHNDVFDTTYQVVWNQIINYTIKLLTPATPPNITYNCTNFLITCKKNNGTNTNIYLNINDTFVKYTNESILEYNWNNSNINNFTATCIINNTISTSNETTLINCTYLTLSSNYFYTFFKLYHHHHHH(SEQIDNO.1)。优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列。更加优选地，编码所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示。ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATAATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACACTAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTACATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGATGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAATAAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATTTTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAATATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTGGAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAATTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCATCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATCACCACCACCACCATCACTG(SEQIDNO.2)。优选地，扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的上游引物信息如SEQIDNO.3所示；扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的下游引物信息如SEQIDNO.4所示。ATCGATTACTGGGTGTCCTT(SEQIDNO.3)；TGTTGATGTTGGAGTTGTTC(SEQIDNO.4)。本专利技术还提供了一种能高效稳定分泌表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，培养物名称为哺乳动物细胞HEK-293T，保藏株号为HEK-293T-CD2v，中文分类名为人胚肾细胞HEK-293T-CD2v，保藏编号为CCTCCNO.C2019275，保藏日期为2019年10月29日，保藏期限为30年。本专利技术还提供了一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在非洲猪瘟免疫血清诊断方面的应用，是采用间接ELISA的方法检测非洲猪瘟的。本专利技术还提供了一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在免疫粘膜佐剂方面的应用。本专利技术意外的发现，将本专利技术的表达CD2v蛋白作为免疫粘膜佐剂，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白和206佐剂联合使用制备疫苗可以诱导动物机体产生针对PEDV的高效价IgA抗体，抵抗病毒感染；这一突破性进展将为PEDVS1亚单位疫苗的研发发挥关键作用，预期该疫苗在临床的应用将彻底控制PED的发生，肌肉注射免疫途径也利于该疫苗在临床的推广。本专利技术在对GENBANK上已知的非洲猪瘟CD2v蛋白核酸序列基础上进行优化合成，构建含ASFV-CD2v基因的重组慢病毒载体，然后包装慢病毒并感染HEK-293T细胞，筛选得到能稳定表达CD2v蛋白的重组细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.如权利要求1所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列。


3.如权利要求2所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，编码所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示。


4.如权利要求3所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，扩增所述氨基酸序列的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红卫，颜仁和，王升启，毛莹莹，王学军，高永新，
申请(专利权)人：广州伯尼兹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44