本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。该抗原表位多肽组合物为为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本试剂盒使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在感染非洲猪瘟病毒抗体。本发明专利技术试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。
ELISA kit for detection of antibodies to synthetic peptide of African classical swine fever virus
【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒
本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)的病原体是非洲猪瘟病毒(ASFV)，ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)。ASFV是囊膜病毒，粒子直径平均为200nm左右；病毒基因组为双链DNA分子，长170-193kb，编码超过150个多肽，其中至少有50个组成了病毒颗粒的不同结构域。80nm的病毒核心包含病毒基因组和核蛋白p10和pA104R，病毒核心由p35、p15、p150、p37、p34和p14蛋白组成的病毒衣壳包裹；围绕着病毒衣壳的是两层脂质分子，内层囊膜由p54、p17、pE248R和p12组成，衣壳结构含有p72、pE120R和pB438L；病毒通过质膜出芽，从宿主细胞释放，在此过程中获得的外层囊膜包含蛋白p24、CD2v、p30和p12。2018年8月，我国暴发非洲猪瘟疫情，这是我国历史上的首次ASF发病记录，自此非洲猪瘟防控工作提升至国内猪病的首要地位，给养殖业带来了毁灭性的打击，极大地影响了我国的生猪供应。非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，易感猪群的病死率高达100％。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。目前针对ASF没有可用的疫苗，事实上也从未成功研制出过有效的ASF商品化疫苗。对该病的控制严格依赖于动物检疫、生物安全措施和扑杀。研发疫苗面临的技术挑战包括以下几个方面：作为已知最大的DNA病毒之一，ASFV基因尚未鉴定和确定功能；没有可用于疫苗生产的病毒增殖细胞系；具有多个不同表型特征的ASFV基因型，候选疫苗的研发中基本没有交叉保护；研制的疫苗既要可用于家猪注射免疫，同时也可以在丛林传播循环的情况下能够对野猪及潜在的其他野生动物进行口服免疫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测非洲猪瘟病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用非洲猪瘟病毒p30、p54和p72抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测猪血清中是否含有非洲猪瘟病毒抗体。为了达到上述目的，本专利技术首先筛选得到了性能优异的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，本专利技术提供的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2、序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，任意三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1；本专利技术还要求保护非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。本专利技术的非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶联反应板包被有非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物溶于pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽或上述多肽组合物，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。所述阳性对照血清为所述非洲猪瘟病毒抗原p30、p54和p72重组蛋白免疫后制备的高免血清；所述阳性对照血清由以下步骤获得：1)分别原核表达非洲猪瘟主要抗原p30基因(如序列4所示)、p54基因(如序列5所示)和p72基因(如序列6所示)，制备三种抗原的重组蛋白；2)分别取所述重组蛋白p30、p54和p72进行免疫，制备高免血清作为试剂盒的阳性储备血清，经样品稀释液适当稀释后作为试剂盒阳性对照血清。所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)的猪血清。所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述试剂盒还包括样品稀释液和20倍浓缩洗涤液；样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。本专利技术试剂盒的检测程序为：1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。9、温育：置37℃温箱，反应30min。10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。检测结果的判定：1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。3、临界值的计算：临界值＝0.17×阳性对照OD450nm值平均值。待检血清测定OD450本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。/n
【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示的多肽、以及序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。
2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物，其特征在于：当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、以及序列2所示的多肽和序列3所示的多肽中的一种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1；当所述多肽组合物为序列1所示的多肽、序列2所示的多肽、序列3所示的多肽中的三种时，三种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1：1。
3.非洲猪瘟病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽。
4.一种非洲猪瘟病毒合成肽ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物或者权利要求3所示的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽。
5.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述非洲猪瘟病毒抗原表位多肽为化学人工合成得到。
6.根据权利要求4所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将权利要求1或2所述的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽组合物或者权利要求3所示的非洲猪瘟病毒抗原表位多肽溶于100μl的pH9...
【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，董春娜，吴冬荀，李静，肖进，李玲，王飞，向王震，李鹏宇，张欣，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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