一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及兽医生物技术领域，具体涉及一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒。本发明专利技术的双抗原间接ELISA试剂盒包含利用大肠杆菌原核表达系统表达得到的非洲猪瘟病毒P30蛋白和截短的P72蛋白。该试剂盒能够有效扩大非洲猪瘟病毒抗体检测的时间范围，同时通过P72蛋白的截短、P72蛋白和P30蛋白的密码子优化、融合蛋白标签等，有效提高了蛋白的可溶表达量，最大程度保留了免疫原决定簇，极大地提高了ELISA试剂盒的特异性和灵敏度，且有效降低了试剂盒的制备成本，在非洲猪瘟病毒的早期诊断、特异性检测和流行病学调查中将发挥重要作用。

A double antigen indirect ELISA kit for detection of antibodies to African swine fever virus

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒
本专利技术涉及兽医生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒的抗原组合物及其制备方法以及用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。非洲猪瘟特征为病程短、病死率高，被世界动物组织(OIE)列为A类疫病。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特征类似虹彩病毒科和痘病毒科，是一种大的、有囊膜的双链DNA病毒，正20面体，直径约175nm-215nm，由外包膜、病毒衣壳、内包膜、核壳、病毒核酸组成。非洲猪瘟病毒的基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，病毒基因组全长为170kb-190kb，中央有125kb左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因。非洲猪瘟病毒基因可编码200多种蛋白质，其中结构蛋白54种。P30是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白和强免疫原性蛋白之一，由CP204L基因编码，蛋白分子量约为36kD。P30有强的免疫原决定簇，能够诱导机体产生中和抗体，通常被用作诊断抗原，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到，常被用于感染后免疫反应的早期检测，基于P30的ELISA方法可提前一周检测到ASFV特异性抗体。在血清学检测技术中，ASFV感染猪在感染后7-10天即可产生特异性抗体，并能维持很长时间，所以可用间接免疫荧光和酶联免疫吸附法(ELISA)等方法检测。其中，ELISA是世界动物卫生组织(OIE)规定的国际贸易检验方法。基于P30的ELISA检测方法更适于病毒感染后的早期检测，因此，仍需要开发适用于更大时间范围检测且具有较高的特异性和灵敏度的检测方法。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种非洲猪瘟病毒的抗原组合物及其制备方法以及用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：首先，本专利技术通过对非洲猪瘟病毒的结构蛋白进行序列和功能的研究，以及不同结构蛋白的抗原性的筛选和组合，发现采用P72蛋白和P30蛋白联合作为检测抗原，不仅能够有效扩大检测适用的感染时间范围而且具有较高的特异性。但是全长P72蛋白在表达时存在表达量低，无法可溶性表达的问题。本专利技术发现采用N端截短的P72蛋白能够提高P72蛋白的可溶表达量。第一方面，本专利技术提供一种抗原组合物，包括非洲猪瘟病毒的P72蛋白和P30蛋白；所述P72蛋白为N端截短蛋白。具体地，上述N端截短的P72蛋白去除了全长P72蛋白N端的第100-410个氨基酸。该N端截短蛋白能够很好地维持P72蛋白的免疫原性，同时能够有效促进P72蛋白的大量表达和可溶表达。优选地，所述P72蛋白具有如下任一种氨基酸序列：(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。所述P30蛋白具有如下任一种氨基酸序列：(1)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；(2)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。优选地，所述抗原组合物中，所述P72蛋白和所述P30蛋白的质量比为(1～3)：(1～3)。以上述比例范围复配使用，能够更好地保证非洲猪瘟病毒抗体检测的特异性和灵敏度。P30蛋白也同样存在可溶表达量较低的问题，为进一步提高所述抗原组合物中各蛋白的可溶表达量以及纯度和收率，进而提高检测的特异性和灵敏度，降低所述抗原组合物的制备成本，所述抗原组合物优选利用原核表达系统分别表达经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因。优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统；所述经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。上述经密码子优化的编码序列为本专利技术经大量人工优化和筛选得到，能够在最大程度地保证P72蛋白和P30蛋白的天然结构以及较高的免疫原性的同时，实现P72蛋白和P30蛋白的高水平、高纯度表达。更优选地，所述经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因的5’端或3’端连接有SUMO标签蛋白编码基因。所述SUMO标签蛋白的编码基因序列如SEQIDNO.7所示。通过连接SUMO标签蛋白能够更好地保证高水平表达可溶性P72蛋白和P30蛋白，简化了纯化工艺并有效保证了P72蛋白和P30蛋白的免疫原性。本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒抗原组合物的制备方法，其包括：利用原核表达系统分别表达经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因。优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统；所述经密码子优化的所述P72蛋白和P30蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。更优选地，所述经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因的5’端或3’端连接有标签蛋白编码基因。上述标签蛋白优选为SUMO标签蛋白。作为本专利技术的优选实施方案，采用大肠杆菌BL21-pET42b表达系统表达经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因。本专利技术提供一种重组大肠杆菌，其包含经密码子优化的P72蛋白的编码基因和/或经密码子优化的P30蛋白的编码基因；所述经密码子优化的P72蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述经密码子优化的P30蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选地，本专利技术提供含有携带所述经密码子优化的P72蛋白的编码基因的pET42b载体的大肠杆菌BL21(DE3)；还提供含有携带所述经密码子优化的P30蛋白的编码基因的pET42b载体的大肠杆菌BL21(DE3)。进一步地，本专利技术提供所述抗原组合物或所述制备方法制备得到的抗原组合物或所述重组大肠杆菌在制备用于检测非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒抗体的试剂或试剂盒中的应用。本专利技术还提供所述抗原组合物或所述制备方法制备得到的抗原组合物或所述重组大肠杆菌在制备用于非洲猪瘟病毒检测的阳性标准品中的应用。本专利技术还提供所述抗原组合物或所述制备方法制备得到的抗原组合物或所述重组大肠杆菌在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用。进一步地，本专利技术提供一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接ELISA试剂盒，其包含所述抗原组合物，或包含由所述制备方法制备得到的抗原组合物，或包含由所述重组大肠杆菌表达的P30蛋白和P72蛋白。优选地，所述双抗原间接ELISA试剂盒中，所述P30蛋白和P72蛋白以1:1的质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗原组合物，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒的P72蛋白和P30蛋白；所述P72蛋白为N端截短蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗原组合物，其特征在于，包括非洲猪瘟病毒的P72蛋白和P30蛋白；所述P72蛋白为N端截短蛋白。


2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其特征在于，所述P72蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(2)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；
和/或，
所述P30蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
(1)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(2)如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的缺失、替换或插入得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的抗原组合物，其特征在于，所述抗原组合物中，所述P72蛋白和所述P30蛋白的质量比为(1～3)：(1～3)。


4.一种非洲猪瘟病毒抗原组合物的制备方法，其特征在于，包括：利用原核表达系统分别表达经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因；
优选地，所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统；所述经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述经密码子优化的非洲猪瘟病毒P72蛋白和P30蛋白的编码基因的5’端或3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐高原，张华伟，周明光，曾小燕，郝根喜，安春敬，朱娴静，孙芳，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42