一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用技术

一种磷脂‑聚乙二醇‑狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用。本发明专利技术涉及实现血脑屏障穿透功能的磷脂‑聚乙二醇‑狂犬病毒衍生肽(DSPE‑PEG‑RVG‑15),通过RVG‑15与乙酰胆碱受体的相互作用介导入脑，可以作为药物递送载体，用于构建释药系统，实现载药入脑的目的。本发明专利技术通过自组装法构建了DSPE‑PEG‑RVG‑15/DOX纳米释药系统，制备方法较简单，经济，所得的纳米粒粒径较小，较均一，颗粒圆整，跨血脑屏障效率较高，毒性较小，具有较好的发展前景。

A phospholipid polyethylene glycol rabies virus derived peptide polymer, its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其制备方法及应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种多肽修饰的脑靶向化药递送系统及其应用，具体涉及一种对血脑屏障高穿透性狂犬病毒糖蛋白(Rabiesvirusglycoprotein,RVG)衍生肽与磷脂-聚乙二醇连接构成的脑靶向递送系统及其应用。
技术介绍
脑是人体重要器官，是生命机能的调节器。脑部疾病已严重危害人类健康，脑部疾病种类繁多，发病机制复杂，且由于血脑屏障(bloodbrainbarrier,BBB)的存在，治疗难度较大。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质由血液进入脑组织。这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。但是BBB同时也可拒绝大部分的药物入脑，使得药物难以到达脑部病灶。为克服跨BBB难题，实现脑部疾病的有效治疗，目前已有报道的方法包括：脑部注射给药(如颅腔内给药)、动脉注射高渗物质暂时打开BBB、将水溶性药物制成脂溶性前药、主动靶向分子介导跨过BBB等。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)，作为科学研究中广泛使用的一种双亲性磷脂-PEG共轭物，含有亲水性PEG和疏水性DSPE。如此独特的DSPE-PEG分子，可以作为辅助型材料用来表面功能化一系列的药物传递系统如基于磷脂的纳米粒子、基于聚合物的纳米粒子、基于无机材料的纳米粒子等。PEG的引入可以降低免疫原性和抗原性，并可达到长循环的功能；DSPE用于作为纳米粒子的疏水性结构以便有效装载药物。嵌段聚合物胶束是药剂学纳米体系研究的重要领域之一，近年来发展迅速。利用两亲型聚合物通过自组装方式形成纳米胶束，药物可以加载于内部疏水核心，也可加载于外部亲水层。阿霉素(DOX)，具有较强的抗肿瘤作用，可以直接作用于DNA，插入DNA的双螺旋链，使后者解开，改变DNA的模板性质，抑制DNA聚合酶从而既抑制DNA合成，也抑制RNA合成。此外，阿霉素具形成超氧基自由基的功能，并有特殊破坏细胞膜结构和功能的作用，是一款经典的广谱抗癌药物。阿霉素的多种制剂临床应用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌等多种恶性肿瘤。但因其不能透过血脑屏障，其对脑胶质瘤的治疗作用不大。主动靶向分子主要是能特异性地结合BBB上的受体或转运体一类分子。采用主动靶向分子修饰的给药系统可模拟BBB上的受体或转运体介导相应内源性的配体或底物跨过BBB转运的过程，此方法能够极大程度地降低脑部损伤，并且可以增加药物的脑部摄取效率。狂犬病毒糖蛋白衍生的由29个氨基酸构成的多肽RVG-29是一种主动靶向分子，可特异性的与血脑屏障上的乙酰胆碱受体进行特异性结合，介导药物跨过血脑屏障，但由于29个氨基酸结构过长，对所形成的纳米颗粒粒径有一定影响。本课题组前期对狂犬病毒糖蛋白衍生肽结构及靶向效率进行考察，筛选出由15个氨基酸构成，脑靶向效率与RVG-29相当的狂犬病毒糖蛋白衍生肽片段。本课题组前期构建了以RVG-15为靶头修饰的脑靶向载体递送核酸入脑，用以治疗脑胶质瘤，体外实验与体内实验均得到较好效果(黄伟.一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用：中国，201710277357.8[P].2017-4-25.)。本专利技术将该狂犬病毒糖蛋白衍生肽RVG-15修饰聚乙二醇-磷脂，构建PE-PEG-RVG-15载药系统，可包载递送传统化药入脑，对那些体外有效但体内难以跨越BBB的药物入脑治疗脑部疾病提供了一个种新方法。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是克服现有脑靶向给药系统的缺陷和不足，提供一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向递送载体及其应用，为解决本专利技术的技术问题，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种脑靶向载体磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其中狂犬病毒衍生肽(RVG-15)可通过n型乙酰胆碱受体介导跨血脑屏障，入脑效率与经典阳性对照药RVG-29相当，而长度缩短近一半，可大幅缩减合成成本，并有利于减小聚合物粒径。RVG-15的氨基酸序列如序列表1所示，所用的氨基酸可为D型或L型，优选L型。聚乙二醇的聚合度n为5～450，优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。R为磷脂基。其中磷脂R可为自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基、二月桂酰磷脂酰乙醇胺中(DLPE)基。优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基。其中，R基的结构如下：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)基：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)基：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)基：二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)基：二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)基：本专利技术中选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，也可用二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)替代，反应条件与使用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)相同。本专利技术中在DSPE-PEG末端引入马来酰亚胺基团(MAL)，RVG-15末端引入半胱氨酸(Cys)，二者可通过加成反应得到聚合物DSPE-PEG-RVG-15，反应如图1示优选的制备方法如下：(1)取摩尔比略大于1：1的RVG-15-Cys和DSPE-PEG2000-MAL溶于pH为8的Hepes，氮气保护下搅拌下常温反应16h。(2)选用截留分子量为200-25000的透析袋进行透析，优选截留分子量为12000的透析袋。去离子水中透析，透析时间为24h。(3)液体冷冻干燥后得冻干粉备用，即得脑靶向复合物磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽(DSPE-PEG2000-RVG-15)。本专利技术将PEG修饰的磷脂类聚合物与具有血脑屏障穿透性的狂犬病毒衍生肽相结合，制备了具有主动靶向作用的长循环载体材料，可以直接或者再经过其他途径用于药物载体、基因载体等用途。本专利技术的再一个方面，提供了上述的磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物在作为体内、体外递送载体的应用。在一个实施方案中，参照梁伟等人的文献(参见YiguangWang,etal,PharmaceuticalResearch,Vol.27,No.2,February2010)，用聚合物包载阿霉素，并进行粒径、透射电镜、包封率的测定。其方法步骤如下：取DSPE-PEG2000-RVG-15于去离子水中，加入DSPE-PEG2000，恒温水浴，再加入阿霉素(DOX)，继续恒温水浴30min，即得DSPE-PEG2000-RVG-15/DOX胶束。其中优选DS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种式(Ⅰ)所示磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其结构组成为：聚乙二醇分子链的一端通过马来酰亚胺基和半胱氨酸连接狂犬病毒衍生肽RVG-15，分子链另一端连接磷脂分子R的胺基端/n

【技术特征摘要】
1.一种式(Ⅰ)所示磷脂-聚乙二醇-狂犬病毒衍生肽聚合物，其结构组成为：聚乙二醇分子链的一端通过马来酰亚胺基和半胱氨酸连接狂犬病毒衍生肽RVG-15，分子链另一端连接磷脂分子R的胺基端





2.根据权利要求1所述的聚合物，狂犬病毒衍生肽RVG-15的序列如序列表1所示。


3.根据权利要求2所述的聚合物，其特征在于，狂犬病毒衍生肽RVG-15氨基酸序列中的氨基酸选自L型或D型氨基酸。


4.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于R为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺基、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺基、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺基、二油酰磷脂酰乙醇胺基或二月桂酰磷脂酰乙醇胺基。


5.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于聚乙二醇的聚合度n优选8～230，进一步优选18～115，更优选25～55，进一步更优选30～50，最优选40～45，进一步最优选45。


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【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟，高钟镐，韩明峰，张哲明，陈丽青，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11