一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用，属于新城疫嵌合疫苗株的拯救及应用领域。本发明专利技术利用新城疫病毒反向遗传操作平台，将新城疫基因GⅦ型毒株的F蛋白裂解位点突变为弱毒株的裂解位点，该突变后的基因VII型新城疫毒株的F和HN基因与基因II型NDV La Sota株的NP、P、M、L构建全长嵌合cDNA序列，并在P和M之间的非编码区插入18bp的核苷酸标记序列。转染细胞拯救获得了新城疫嵌合病毒NDV DC株。本发明专利技术构建的嵌合病毒在鸡胚和细胞中均能达到较高的培养滴度。嵌合后的毒株含有基因VII型新城疫毒株的囊膜表面糖蛋白，并含有基因II型毒株的骨架，兼具新城疫基因VII型毒株的免疫原性和基因II型La Sota株的高繁殖和高安全特性。

【技术实现步骤摘要】
一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用
本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用。
技术介绍
鸡新城疫也叫作亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是一种由新城疫病毒引起的急性败血性传染病，该病具有高度接触传染性。鸡科动物都能感染患病，家鸡是最易感的群体,雏鸡易感性高于成年鸡。该病的死亡率较高，发病没有明显的季节特点，一年四季都能感染患病,但春季和秋季是该病的高发季节。患病鸡具有典型的呼吸困难、下痢、神经萎靡及黏膜、浆膜出血的症状。在发病开始初，首先出现呼吸道症状，表现为患病鸡呼吸不畅，同时伴随咳嗽和喘息，呼吸时有“呼噜”声，口腔和鼻腔内有黏稠的分泌物，摇头。在患病周期内，会时不时地有患病鸡只死亡，大多数患病鸡会在患病1周后逐渐康复，但如果治疗不及时会增加死亡率。病程较长的鸡只粪便呈白色或淡绿色，部分患病鸡会表现出神经症状，走路摇晃，经常抬头；产蛋鸡患病会影响产蛋率，且蛋品质严重下降，部分患病鸡会出现异常的蛋量增多。该病给养禽业带来了巨大的经济损失。近来我国流行的NDV多属于基因Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型，尤其是基因Ⅶ型较多，而我国使用的弱毒疫苗多为基因Ⅰ、Ⅱ型。我国现有疫苗对流行株的保护力有限，甚至基本没有保护。因此，亟需开发研制新型有效的疫苗以达到有效防治该类传染病之目的。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术专利设计了一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，将裂解位点突变的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列同时与新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因序列构建新城疫嵌合病毒疫苗株。基于此方法本专利技术设计了一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株，所述NDVDC株的全基因序列如SEQIDNo.1所示，含有裂解位点突变的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列，并含有新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因序列，所述NDVDC株的建议分类名为：鸡新城疫病毒，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2020年3月5日，保藏编号为：CGMCCNo.19298。所述NDVDC株的核苷酸序列的第3170个核苷酸处，P基因序列和M基因序列之间的非编码区插入了如SEQIDNo.3所示的标记性核苷酸序列。上述新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，包括如下步骤：(1)合成含有如SEQIDNo.2所示的突变裂解位点后的新城疫基因VII型F基因序列和基因VII型的HN基因序列，并扩增新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因的全长cDNA质粒pOK-rNDV，按照NP(LaSota)、P(LaSota)、M(LaSota)、F(新城疫基因VII型)、HN(新城疫基因VII型)和L(LaSota)基因的顺序将各基因组克隆至pOK12载体中；(2)在基因P和M之间(第3170个核苷酸处)插入标记序列TagSeq：TTTCGCGAGGCGCGCCAA；在序列的5’上游引入T7启动子序列，在序列的3’端引入具有自我剪切功能的丁肝核酶序列和具有终止T7启动子转录功能的T7终止子序列，将cDNA片段在共有的限制性酶切位点进行连接，并且在转录质粒pOK12中装配为pOK-rNDV-DC质粒；(3)分别将新城疫基因II型LaSota株的全长NP、P和L基因插入pCI-neo载体，构建辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L；(4)将含有标签的质粒pOK-rNDV-DC与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK-T7细胞，培养96h，细胞反复冻融后取细胞上清，接种9～11日龄SPF鸡胚，收获病毒液即得鸡新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株。所述步骤(4)中BHK-T7细胞的构建方法为：a、以NCBI官网记录的T7RNA聚合酶基因序列为基础合成序列，构建PMV-T7RNApolymerase质粒；b、将PMV-T7RNApolymerase质粒与P1020载体连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞，并通过PCR鉴定和测序鉴定筛选出P1020-T7RNApolymerase阳性质粒；c、将重组构建的P1020-T7RNApolymerase质粒使用质粒大提试剂盒提取质粒，确认无误后进行后续实验；d、基于电穿孔法将P1020-T7RNApolymerase质粒转染至培养好的BHK-21贴壁细胞；分别依次通过再96孔板、24孔板和6孔板中培养细胞株，完成了细胞株的筛选过程；e、对筛选出的细胞株进行扩增，使用WB检测方式筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株，命名为BHK-T7细胞。进一步的，所述步骤(4)中转染BHK-T7细胞方法具体为：将BHK-T7细胞接种于六孔板中，待其生长至80％～90％的单层细胞时开始转染，转染前用PBS轻轻洗涤细胞3次，将EAM01培养基换为opti-MEM培养基，将构建好的全长质粒pOK-rNDV-DC和3个辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L用转染试剂LipofectamineTM2000按照合适的的比例共转染BHK-T7细胞。转染后更换培养基为EAM01培养基。混合均匀后继续培养4天，转染后每日观察，适时换液。本专利技术还公开了步骤(4)中新城疫嵌合病毒标记疫苗株的拯救方法，收获上述培养液及细胞，反复冻融3次后离心，取上清接种10日龄SPF鸡胚(200μl/枚)，接种后的SPF鸡胚继续培养5天后收集尿囊液进行HA检测，选取HA阳性的尿囊液进行分装，提取RNA并进行测序，鉴定正确后，将拯救出来的病毒命名为NDVDC株，并作为拯救病毒的第一代，进行连续10次传代，以获得具有稳定HA活性的病毒。测定每代病毒液的HA活性，选取第1代(F1)、第2代(F2)、第3代(F3)、第5代(F5)和第10代(F10)病毒进行序列测定。测序新拯救的病毒基因组为基因VII型的F(突变裂解位点)和HN序列，并含有LaSota株的NP、P、M和L基因；并含有构建时引入的分子标签，病毒获得成功拯救。同时本专利技术获得的新城疫嵌合病毒NDVDC株可用于制备新城疫疫苗，具体制备方法为：(1)将鉴定正确的新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株接种到鸡胚中培养72～96h后收获尿囊液；将尿囊液收获后按照1％的比例接种BHK-21-SC悬浮细胞，加入TPCK胰酶培养72h收获细胞培养液，即为新城疫嵌合标记疫苗株NDVDC株细胞毒抗原液；(2)在收获的病毒液中按照比例加入甲醛、β-丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)灭活剂进行灭活；(3)将灭活后抗原液与油佐剂、铝佐剂、蜂胶佐剂、油水双相佐剂中的一种按照比例进行搅拌乳化获得均一的乳剂而获得。本专利技术上述的的新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株临床鉴别的方法为：(1)设计并合成鉴别用特异性引物，上游引物JD-F：5’-CACGCCCAATGCACCCGAGTTC-3’下游引物JD-R：5’-CAGCACTTGGGGTGCCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，其特征在于，将裂解位点突变的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列同时与新城疫基因II型La Sota株的NP、P、M和L基因序列构建新城疫嵌合病毒疫苗株。/n

【技术特征摘要】
1.一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，其特征在于，将裂解位点突变的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列同时与新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因序列构建新城疫嵌合病毒疫苗株。


2.一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株，其特征在于，新城疫嵌合病毒标记疫苗株命名为NDVDC株，该新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株的全基因序列如SEQIDNo.1所示，含有裂解位点突变的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列，并含有新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因序列，所述NDVDC株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.19298。


3.根据权利要求2所述新城疫嵌合病毒标记疫苗株，其特征在于，所述NDVDC株的核苷酸序列的第3170个核苷酸处，P基因序列和M基因序列之间的非编码区插入了如SEQIDNo.3所示的标记性核苷酸序列。


4.根据权利要求1所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成含有如SEQIDNo.2所示的突变裂解位点后的新城疫基因VII型F基因序列和HN基因序列，并扩增新城疫基因II型LaSota株的NP、P、M和L基因的全长cDNA质粒pOK-rNDV，各基因组的排列顺序为NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因；
(2)在位于质粒pOK-rNDV的第3170个核苷酸处插入标记序列，序列为TTTCGCGAGGCGCGCCAA，构建含有标签的质粒pOK-rNDV-DC；
(3)分别将新城疫基因II型LaSota株的全长NP、P和L基因插入pCI-neo载体，另外构建辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L；
(4)将含有标签的质粒pOK-rNDV-DC与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BHK-T7细胞，培养96h，细胞反复冻融后取细胞上清，接种9～11日龄SPF鸡胚，收获病毒液即得鸡新城疫嵌合病毒标记疫苗株NDVDC株。


5.根据权利要求4所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中质粒pOK-rNDV-DC在序列的5’上游引入T7启动子序列，在序列的3’端引入具有自我剪切功能的丁肝核酶序列和具有终止T7启动子转录功能的T7终止子序列。


6.根据权利要求5所述的新城疫嵌合病毒标记疫苗株的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中BHK-T7细胞的构建方法为通过转染的方法将T7RNA聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凌云，闫召璐，谢田田，张博，郑杰，马宁宁，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，北京鼎持生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33