一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法技术

本发明专利技术公开了生物医药领域的一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，具体包括以下步骤，S1：试剂准备；S2：克隆质粒的制备；S3：构建PRV真核转移质粒pEGFP‑CP204L；S4：PRV和pEGFP‑CP204L质粒DNA的共转染；合成P30蛋白基因(CP204L)片段，构建转移质粒pEGFP‑CP204L，利用经典的同源重组方式将ASFV CP204L基因插入PRV基因组替换gI和gE毒力基因，构建共表达P30蛋白的重组伪狂犬病毒株rXJ gE/gI‑CP204L可用于预防ASFV和PRV感染；克隆质粒制备简单，成本较低，适用于产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种表达ASFVP30蛋白的PRVgE/gI双基因缺失株的构建方法
本专利技术涉及生物医药
，具体为一种表达ASFVP30蛋白的PRVgE/gI双基因缺失株的构建方法。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性、致死性动物传染病。非洲猪瘟除了能够感染所有品种和各年龄段的猪，其中表现为高热、全身出血、呼吸障碍和神经症状等症状。由于非洲猪瘟病毒毒力差异，非洲猪瘟的感染过程和临床症状有明显的差异，最急性和急性型感染致死率高达100％。至今世界范围内无有效疫苗，ASFV的扩散额蔓延将给养猪业带来毁灭性的打击。2018年8月3日，我国首次爆发非洲猪瘟疫情，截止2019年9月17日，全国已有31个省份发生非洲猪瘟疫情共154起，给中国养猪业带来巨大经济损失。p30蛋白在病毒感染的早期进行表达，具有比较好的抗原性，因此可以用该基因开发非洲猪瘟疫苗。伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus)是猪奥耶斯基氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达ASFV P30蛋白的PRV gE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤，/nS1：试剂准备：/nLB液体培养基；限制性快切酶(Xho I、Sal I)；Lipefectamine TM 3000转染试剂；去内毒素质粒小量抽提试剂盒；DH5α大肠杆菌感受态细胞；/nS2：克隆质粒的制备：/nS2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入Xho I酶切位点，3’端引入Sal I酶切位点，酶切位点后加AA碱基，合成CP204L基因片段，将CP204L基因片段克隆至载体pMD19-T的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本pMD19-CP204L；/nS2.2：将上...

【技术特征摘要】
1.一种表达ASFVP30蛋白的PRVgE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤，
S1：试剂准备：
LB液体培养基；限制性快切酶(XhoI、SalI)；LipefectamineTM3000转染试剂；去内毒素质粒小量抽提试剂盒；DH5α大肠杆菌感受态细胞；
S2：克隆质粒的制备：
S2.1：在P30蛋白基因(CP204L)5’端引入XhoI酶切位点，3’端引入SalI酶切位点，酶切位点后加AA碱基，合成CP204L基因片段，将CP204L基因片段克隆至载体pMD19-T的多克隆位点上，得重组质粒，即为亲本pMD19-CP204L；
S2.2：将上述亲本质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑取白色转化菌落，提取质粒后质粒酶切电泳及质粒测序验证插入正确的片段。
S3：构建PRV真核转移质粒pEGFP-CP204L：
S3.1：pEGFP-gI28k质粒DNA抽提；
S3.2：pMD19-CP204L和pEGFP-gI28k质粒的酶切回收；
S3.3：基因和质粒pEGFP-gI28K的连接；
S3.4：感受态细胞的转化；
S3.5：PRV真核转移质粒pEGFP-CP204L去内毒素质粒提取。
S4：PRV和pEGFP-CP204L质粒DNA的共转染：
先将pEGFP-CP204L质粒DNA根据LipefectamineTM3000转染试剂盒说明书转染入293T细胞，在转染10h后加入PRVXJ株病毒液，同源重组构建gE基因和gI基因缺失，共表达CP204L基因的重组伪狂犬病毒株rXJgE/gI-CP204L。


2.根据权利要求1所述的一种表达ASFVP30蛋白的PRVgE/gI双基因缺失株的构建方法，其特征在于：所述步骤S1中，LB液体培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志文，朱玲，曾喻兵，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51