【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及兽医生物学，具体涉及一种适应无血清全悬浮培养的df1细胞及其构建方法、应用。
技术介绍
1、悬浮培养工艺已经广泛应用于生物制药领域，而且已经在生物制药领域展现出了明显的优势。与转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术的最大优势在于：第一、单位面积内有效工作细胞数量增加；第二、全封闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量也获得提高；第四、生产疫苗所用的劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。
2、全悬浮培养工艺是一种脱离载体的细胞培养工艺。利用悬浮培养驯化的方法将df1贴壁细胞驯化为无血清全悬浮培养的df1细胞，并通过筛选获得高病毒产量的悬浮细胞株，应用于病毒的无血清全悬浮生产，实现抗原生产工艺和质量的提升，生产成本的降低。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。但现有驯化得到的df1细胞都只适用于某一种病毒的高质量生产，针对不同的病毒的培养往往需要筛选出多株细胞供生产使用。
技术实现思路
1、为解决现有
2、本专利技术公开了一种无血清全悬浮培养的df1细胞，所述df1细胞建议分类命名为鸡成纤维细胞，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.45453，所述df1细胞能用于鸡传染性法氏囊病毒(ibdv)、鸡新城疫病毒(nd)或鸡禽流感病毒(aiv)三种病毒的高产率培养。
3、进一步的，本专利技术还公开了一种如上所述的适应无血清全悬浮培养的df1细胞的构建方法，所述构建方法步骤为：
4、(1)细胞复苏，从液氮罐中取出冻存的df1贴壁细胞，在37℃水浴中快速摇动使其迅速融化，以800rpm/min离心5min，弃上清，用适量含10％胎牛血清的eam03细胞培养液重悬，移入t75中，于37℃、5％co2培养箱中静置培养至长满单层；
5、(2)细胞传代，将复苏后的df1细胞置于含10％胎牛血清的eam03培养液中进行培养，待df1细胞长满单层时，加入适量0.25％edta-trypsin 37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含10％胎牛血清的eam03细胞培养液终止，用无菌移液管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：5的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2～3代；
6、用含1％胎牛血清的f806悬浮培养基重悬细胞，混匀，计数，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，于37℃、5％co2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为140rpm/min，观察并计数，连续传代3代；
7、(3)低血清悬浮驯化，将步骤(2)中的细胞按照1×106/ml密度接种到含有30ml低血清悬浮培养基的125ml细胞摇瓶中进行驯化培养，所述低血清悬浮培养基为含2％胎牛血清f802a培养基，培养温度为37±5℃，5％co2，摇床转速为140rpm/min；每隔48h计数观察细胞密度、细胞活率以及结团状态，结团严重时离心舍去上清，使用edta-trypsin消化后使用30ml的新鲜f802a培养基重悬后再次进行计数；细胞密度不足1×106cells/ml时或者活率不到80％时，按照800rpm/min，5min进行离心换液；待多代传代后细胞稳定在2×106cells/ml并且活率在80％以上时，按照1×106cells/ml细胞密度稀释传代，每隔72h计数记录细胞数以及活率，观察细胞结团状况；
8、(4)无血清培养，待细胞适应低血清培养基，倍增时间稳定后，按照1×106cells/ml的密度接种到无血清f802a培养基中，140rpm/min、37℃动态培养；每72h计数观察细胞数、活率以及结团率；细胞数不足2×106cells/ml时使用步骤(3)中的细胞补足，结团率高于50％时进行edta-trypsin消化，待72h细胞密度大于4×106cells/ml，活率>95％，细胞生长稳定，认为df1细胞已适应无血清培养基培养；
9、(5)单克隆细胞株筛选，取100μl的1×106cells/ml的生长状态良好的适应无血清培养的df1悬浮细胞，加入200ml含有10％胎牛血清的细胞生长液，充分混匀后铺在10块96孔板中，每孔200μl,将96孔板置于温度为37±0.5℃的二氧化碳培养箱中培养10d后，显微镜下观察，筛选出仅有唯一一个单群落的细胞孔进行扩增，选取多株生长状况较佳的细胞株，每个细胞株均分别接种鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒和鸡禽流感病毒3种病毒，筛选出对3种病毒均有高产毒能力的一株细胞。
10、进一步的，所述步骤(5)中对筛选出的仅有唯一一个单群落的细胞孔的细胞株进行扩增方法为：细胞株长满整个细胞孔时，将细胞培养液吸出、弃掉；用胎牛血清洗1次，确保没有残存原培养基及血清；取80μl edta-trypsin分散滴加至96孔板中筛选出的单克隆df1细胞中，加完轻轻晃动，让每一个位置的细胞都可以与edta-trypsin充分接触，将容器放入5％的co2培养箱中消化5～10min；显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，消化的同时将所需扩增的24孔板内放入新鲜的预热的细胞培养液，吸取一定量的24孔板中细胞培养液，移至消化的细胞中吹吸混悬，吹散细胞，再将细胞悬液吸取移回至24孔板中，反复2次，确保细胞完全转移干净，将转移完的24孔板放至显微镜下观察是否有细胞，此时细胞为动态、圆形，观察确定转移成功后将24孔板放入培养箱中静置培养；待24孔板中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至6孔板中，待6孔板中细胞长满后，转移至125ml摇瓶中。三天后计数并镜下观察细胞状态。此时细胞状态饱满圆润，轮廓清晰，按照1×106cells/ml接种，三天后计数，直到细胞生长状态稳定。
11、本专利技术公开的上述的无血清全悬浮培养的df1细胞能够应用在培养疫苗病毒中，培养效果好、产毒能力高，所述疫苗病毒包括鸡传染性法氏囊病毒(ibdv)、鸡新城疫病毒(nd)或鸡禽流感病毒(aiv)。同时，本专利技术公开的上述无血清全悬浮培养的df1细胞能够应用于鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒或鸡禽流感病毒的全病毒疫苗的生产。
12、进一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无血清全悬浮培养的DF1细胞，其特征在于，所述DF1细胞建议分类命名为鸡成纤维细胞，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.45453，所述DF1细胞能用于鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒和鸡禽流感病毒三种病毒的高产率培养。
2.一种如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的DF1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤为：
3.根据权利要求2所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中对筛选出的仅有唯一一个单群落的细胞孔的细胞株进行扩增方法为：细胞株长满整个细胞孔时，将细胞培养液吸出、弃掉；用胎牛血清洗1次，确保没有残存原培养基及血清；取80μl EDTA-Trypsin分散滴加至96孔板中筛选出的单克隆DF1细胞中，加完轻轻晃动，让每一个位置的细胞都可以与EDTA-Trypsin充分接触，将容器放入5％的CO2培养箱中消化5～10min；显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，
4.一种如权利要求1所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞在培养疫苗病毒中的应用。
5.根据权利要求4所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞在培养疫苗病毒中的应用，其特征在于，所述疫苗病毒包括鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒和鸡禽流感病毒。
6.一种如权利要求1所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞用于培养疫苗病毒的方法，其特征在于，所述病毒为鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒或鸡禽流感病毒，所述方法为：用病毒培养液根据接种比例将病毒稀释到一定浓度，随后将稀释好的毒种接种到生产用种子单层贴壁细胞中进行培养，镜下观察病变，80％细胞发生病变时分别收获毒液，为种毒F1代；取如权利要求1所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞于无血清的F802a培养液中，于37℃、5％CO2培养箱中悬浮培养72h，转速为140rpm；待DF1细胞生长稳定、活率≥95％、结团率低于25％时，细胞密度到2×106cells/ml，按0.01～0.6MOI的比例接入上述悬浮培养制备的种毒，置于37℃的二氧化碳培养箱中的摇床上培养，72～96h收毒。
7.一种如权利要求1所述的无血清全悬浮培养的DF1细胞在生产全病毒疫苗中的应用，其特征在于，所述病毒疫苗为鸡传染性法氏囊病毒疫苗、鸡新城疫病毒疫苗或鸡禽流感病毒疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种无血清全悬浮培养的df1细胞，其特征在于，所述df1细胞建议分类命名为鸡成纤维细胞，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.45453，所述df1细胞能用于鸡传染性法氏囊病毒、鸡新城疫病毒和鸡禽流感病毒三种病毒的高产率培养。
2.一种如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的df1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤为：
3.根据权利要求2所述的无血清全悬浮培养的df1细胞的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中对筛选出的仅有唯一一个单群落的细胞孔的细胞株进行扩增方法为：细胞株长满整个细胞孔时，将细胞培养液吸出、弃掉；用胎牛血清洗1次，确保没有残存原培养基及血清；取80μl edta-trypsin分散滴加至96孔板中筛选出的单克隆df1细胞中，加完轻轻晃动，让每一个位置的细胞都可以与edta-trypsin充分接触，将容器放入5％的co2培养箱中消化5～10min；显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，消化的同时将所需扩增的24孔板内放入新鲜的预热的细胞培养液，吸取一定量的24孔板中细胞培养液，移至消化的细胞中吹吸混悬，吹散细胞，再将细胞悬液吸取移回至24孔板中，反复2次，确保细胞完全转移干净，将转移完的24孔板放至显微镜下观察是否有细胞，此时细胞为动态、圆形，观察确定转移成功后将24孔板放入培养箱中静置培养；待24孔...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋春雨，司欢欢，侯野，
申请(专利权)人：浙江鼎持生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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