构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途技术

本发明专利技术涉及一种利用表达上调水平的miRNA‑155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的体外模型以及该模型在开发肿瘤疫苗中的用途。具体而言，本发明专利技术涉及采用离体的肿瘤细胞培养上清液构建得到肿瘤相关条件培养基，同时将miRNA‑155的编码基因导入离体的树突状细胞中来上调树突状细胞中的miRNA‑155的表达水平，随后将miRNA‑155表达水平上调后的树突状细胞与所述肿瘤相关条件培养基和水凝胶混合后，通过3D细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。

【技术实现步骤摘要】
构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途
本专利技术涉及肿瘤免疫学领域，更具体而言，涉及一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的体外模型以及该模型在开发肿瘤疫苗中的用途。
技术介绍
在肿瘤免疫疗法和疫苗开发的背景下，由于其具有激活幼稚T细胞的独特能力，树突状细胞（DC）作为免疫系统的核心处理单元尤为令人关注（参见，X.Zheng等，SilencingIDOindendriticcells:anovelapproachtoenhancecancerimmunotherapyinamurinebreastcancermodel，Internationaljournalofcancer，132(4)，(2013)967-77）。同时，本领域已知树突状细胞在控制肿瘤发生发展的过程中扮演着重要角色，而且在肿瘤疫苗开发中，DC作为“天然的佐剂”而受到关注。然而，肿瘤微环境形成的免疫抑制是肿瘤成功地实现免疫逃逸的重要机制之一。另外，本领域已知在适应性免疫系统和先天免疫系统的细胞中选择性地表达100多种微小RNA（miRNA），且已知miRNA可以调节多种免疫细胞（例如，T细胞、NK细胞和B细胞等）的功能（J.C.Dudda等，MicroRNA-155isrequiredforeffectorCD8+Tcellresponsestovirusinfectionandcancer，Immunity，38(4)(2013)742-53）。但是，目前对于miRNA与构建肿瘤微环境之间的关系，尚缺乏相关的研究。就肿瘤疫苗开发而言，由于体内代谢过程较为复杂，采用动物模型难以有效、直观地观察到该疫苗在动物体内的肿瘤环境中的情况以及肿瘤免疫逃逸的情况。并且，相对于细胞模型而言，动物模型的开发更加复杂且成本更高。然而，目前的细胞模型与体内肿瘤微环境差异明显。因此，如何成功地构建能够良好地模拟体内肿瘤微环境的体外模型，对于肿瘤疫苗开发而言具有重要意义。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术人通过研究发现，当DC处于体外的肿瘤微环境中时，通常会导致DC功能障碍，表现为不成熟的状态，这将造成体外的肿瘤微环境模型与体内的肿瘤微环境之间存在极大的差异，并由此使得无法通过体外模型直观地研究疫苗在体内的代谢情况；而通过上调miRNA-155的表达水平能够增强离体的DC的活力和迁移，并由此提高成熟标记物CD80和MHCII的表达，从而使DC以成熟的状态存在于肿瘤微环境（TME）体外模型中，由此得到的TME体外模型能良好地模拟体内肿瘤微环境。本专利技术的一个方面是提供一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。本专利技术的另一方面是提供采用上述方法构建得到的肿瘤微环境体外模型，其中，所述体外模型包括：水凝胶，以及进行三维细胞培养后的表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。本专利技术的又一方面是提供上述的肿瘤微环境体外模型在开发肿瘤疫苗中的用途。相对于利用miRNA-155表达水平未上调的树突状细胞制备的肿瘤微环境体外模型而言，采用本专利技术的方法制备的肿瘤微环境体外模型具有如下优点：（1）能够保持细胞的活力并使细胞迁移能力提高大于1倍；（2）分别增高DC的成熟标志物CD80和MHCII的表达水平，且提高总荧光强度；（3）提升激活特异性T细胞增殖的能力并分别增高抗肿瘤因子IFN-γ和IL-2的分泌。而且，相对于采用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞进行二维培养来制备肿瘤微环境体外模型而言，采用本专利技术的方法制备的肿瘤微环境体外模型能够更好地模拟体内肿瘤的微环境，为开发疫苗奠定基础。附图说明图1为示出树突状细胞的miRNA-155的相对表达水平的图表。其中示出了在三维肿瘤培养环境中，野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl中的miRNA-155的相对表达水平。NS代表差异不显著，*代表P<0.05，**代表P<0.01。图2为示出野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl的细胞迁移率的图表，其中，在相同的条件下，相对于野生型BMDC，BMDC-155表现出显著更高的迁移率。NS代表差异不显著，*代表P<0.05。图3为示出树突状细胞的成熟度的图表。其中，图3A示出了通过流式细胞术检测到的各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）表面的成熟标志物CD80的表达百分比和总荧光强度；图3B示出了通过流式细胞术检测到的各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）表面的成熟标志物MHCII的表达百分比和总荧光强度。其中，NS代表差异不显著，*代表P<0.05。图4为示出不同的DC激活的T淋巴细胞增殖程度的图表。其中，通过流式细胞术检测到，比起野生型BMDC，BMDC-155与T细胞混合培养后，能够显著激活T细胞的增殖能力。图5为示出细胞因子IFN-γ和IL-2各自的表达量的图表。图5A示出了各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）和T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的IFN-γ的表达量；图5B示出了示出了各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）和T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的IL-2的表达量。NS代表差异不显著，*代表P<0.05。图6为示出3D培养的野生型BMDC和BMDC-155的共聚焦显微镜图像，其中，箭头指示出伸展的细胞。图7为示出2D培养的DC（左侧）和3D培养的DC（右侧）的共聚焦显微镜图像，其中，箭头指示出伸展的细胞。图8为示出将经2D培养的DC和经3D培养的DC分别同T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ的表达量的图表。其中，*代表P<0.05。具体实施方式除非另有定义，否则本文使用的科技术语具有与本专利技术所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。参见例如Singleton等，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology2nded.，J.Wiley&Sons（NewYork，N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：/n（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；/n（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；/n（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；/n（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：
（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；
（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；
（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为来自选自如下的一种或多种癌症的细胞：肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、白血病及淋巴瘤；
优选地，所述肿瘤细胞选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H810、人鼻咽癌细胞CNE1、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞CCL229、人肝癌细胞SNU-368、小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MDA-231、MCF-7细胞、SKBR3细胞、Hela细胞、小鼠结肠癌细胞CT-26、人结肠癌细胞WiDr、人结肠腺癌细胞CW-2、小鼠肾癌细胞Renca、人白血病细胞NB4、人白血病细胞HL-60、HepG2细胞、A549细胞、HT-29细胞或人淋巴瘤细胞HTL-90；
优选地，在步骤（1）中，采用选自如下的培养基对所述离体的肿瘤细胞进行培养：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基；
优选地，在步骤（1）中，所述培养在30℃~40℃、3%~10%CO2的条件下进行；进一步优选地，所述培养的过程包括：将所述肿瘤细胞在所述培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h；
优选地，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。


3.如权利要求1或2所述的方法，其中，用含有miRNA-155的编码基因的重组表达载体转染离体的树突状细胞，从而导入所述miRNA-155的编码基因；
优选地，所述重组表达载体选自miRNA-155过表达慢病毒载体、miRNA-155过表达腺病毒载体或miRNA-155过表达重组质粒载体；
优选地，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍。

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【专利技术属性】
技术研发人员：杨鹏翔，接晶，杨宇民，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32