本发明专利技术提供了一种使人的体细胞逆向分化产生自体胰腺干细胞和自体胰岛的方法，所述方法包括：采用含有不同植物提取物和蛋白成分的培养液分步骤培养人的体细胞，从而使所述体细胞逆向分化产生自体胰腺干细胞，进而培养产生自体胰岛。本发明专利技术的方法在2-3周内即可产生几百亿数量级别的第1代自体胰腺干细胞和自体胰岛细胞。这种植物和蛋白诱导性人自体胰腺干细胞具有与人自然胰腺干细胞类似的细胞特异表型和多种细胞分化能力，该自体胰腺干细胞及自体胰岛细胞不仅对胰岛素缺乏型糖尿病等胰腺疾病治疗应用领域，而且在自体胰腺组织工程领域具有巨大潜力，本发明专利技术还适用于建立新型的自体胰腺干细胞库，长期永久保存自体胰腺干细胞。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，本专利技术涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体胰腺干细胞和自体胰岛的细胞培养方法及其应用。
技术介绍
在胚胎时期胰腺发生发育中，多能干细胞逐步分化生成几种内分泌细胞，最早出现的是产生胰高血糖素和胰岛素的细胞，即胰岛(Langerhans岛)。到了出生后2_3周，胰岛的轮廓已经分明、成熟；这时，胰腺中已经几乎看不到胰腺多能干细胞的活动，停止了产生新胰岛的活动；不仅如此，由于胰腺中产生胰岛素的胰岛细胞的再生能力非常弱，引起胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的各种病因，造成的胰岛变性坏死和胰岛的丢失是一个终端过程，因此，IDDM患者终生都依赖外源性胰岛素。糖尿病(diabetes mellitus,DM)成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三大疾病。随着人们生活水平的提高，环境因素，人口老龄化以及肥胖发生率的增加，糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。糖尿病发病机制复杂，自1921年制备出胰岛素至今，糖尿病的治疗以药物、注射胰岛素为主。但这些方法既不能精确调节体内血糖水平，也不能阻止糖尿病并发症的发生。从原理上，胰腺或胰岛移植是根治胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的方法。几十年来，欧美国家研发异体胰腺或异体/异种胰岛移植治疗胰岛素依赖性糖尿病取得了短期临床效果。但因供体组织来源严重匮缺，以及异体胰腺或异体/异种胰岛移植后出现的免疫排斥后丧失临床效果。研发自体胰腺干细胞和自体胰岛的生产技术成为解决根治胰岛素依赖性糖尿病的当务之急。近年来，应用基因重组技术已经证明，体细胞可以被重新编码而逆向分化，产生被称为诱导性自体多能干细胞(iPS干细胞)，为自体干细胞的生产技术提供了新的途经。体细胞是干细胞顺向分化产生的，具有某些具体功能的子代细胞。体细胞的染色体DNA和干细胞的染色体DNA在基因结构和基因的数量上并不存在差异。体细胞和干细胞之间的最主要的差别可能只是某些功能基因处于不同的活性表达状态。功能基因表达的差异决定了细胞的具体功能和形态的差异。我们推测，干细胞向体细胞顺向分化的程序启动后，干细胞本身的干细胞特性决定基因的开关就被关闭，随后，干细胞就分化形成了具有某种特定功能的体细胞；换句话说，在体细胞染色体DNA序列中仍然存在胰腺干细胞特性决定基因，例如PdX-l、NkX2. 2和1^x7基因等，这些基因只是处于关闭或静止状态。利用某些物质打开体细胞DNA序列中的胰腺干细胞特性决定基因Pdx-I、Nkx2. 2和1^x7等基因开关，这些体细胞就可能重新逆向分化而形成新的胰腺干细胞，进而分化形成自体胰岛。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是研发一种新的人的体细胞逆向分化调控技术，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，应用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在体外重新激活体细胞DNA序列中的胰腺干细胞特性决定基因开关，使这些体细胞重新逆向分化而形成新的胰腺干细胞和自体胰岛。为了解决上述技术问题，本专利技术的一个目的是提供使人的体细胞逆向分化产生自体胰腺干细胞的方法。本专利技术的另一个目的是提供采用该自体胰腺干细胞产生自体胰岛的方法。本专利技术的又一个目的是提供通过上述方法获得的自体胰腺干细胞和自体胰岛，以及其在制备治疗多种疾病的药物中的应用。本专利技术的再一个目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多种细胞培养液以及该培养液的应用。此外，本专利技术还提供相应的用于制备自体胰腺干细胞和自体胰岛的试剂盒。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的一方面，本专利技术提供一种使人的体细胞逆向分化产生自体胰腺干细胞的方法，所述方法包括将人的体细胞在细胞培养液Cl中培养48-72小时，所述细胞培养液Cl为RPMI 1640，并含有苦瓜提取物5-100mg/ml、Y-27632 (Sigma公司)1-25 μ Μ、干细胞因子(stem cell factor) 1-lOOng/ml、白细胞介素 3 (IL-3) 1-lOOng/ml、白细胞介素 6 (IL-6) 1-lOOng/ ml ；然后换用细胞培养液C2培养9-15天，所述细胞培养液C2为RPMI 1640，并含有苦瓜提取物 5-100mg/ml、天麻提取物 5-100mg/ml、Y-276321_25 μ Μ、干细胞因子 l-100ng/ml、白细胞介素31-lOOng/ml、白细胞介素61-lOOng/ml，从而获得植物和蛋白诱导性自体胰腺干细胞。优选地，在5% CO2和37°C条件下进行细胞培养。在上述方法中，所述人的体细胞包括但不限于人的周围血液细胞、脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、脂肪细胞。优选地，在将人的体细胞以细胞培养液Cl培养之前，先以2-5X IO6的密度，在5% CO2和37°C条件下培养M-48小时。优选地，先将细胞在细胞培养液Cl中培养72小时，所述细胞培养液Cl为含有苦瓜提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、干细胞因子10ng/ml、白细胞介素3 10ng/ml、白细胞介素610ng/ml的RPMI 1640 ；然后换用细胞培养液C2培养9_12天，所述细胞培养液C2为含有苦瓜提取物50mg/ml、天麻提取物50mg/ml、Y_27632 10 μ Μ、干细胞因子lOng/ml、白细胞介素310ng/ml、白细胞介素6 10ng/ml的RPMI 1640，从而获得植物和蛋白诱导性自体胰腺干细胞。另一方面，本专利技术提供一种产生自体胰岛的方法，所述方法包括采用细胞培养液 C3培养上述得到的植物和蛋白诱导性自体胰腺干细胞，培养9-12天形成胰岛，所述细胞培养液 C3 为 RPMI 1640，并含有天麻提取物 5_100mg/ml、烟酰胺(Nicotinamide) I-IOOng/ ml、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) l-100ng/ml、胰岛素1-lOOng/ml、转化生长因子 β (TGF-i3)l-100ng/ml、胰岛素样生长因子 1 (IGF-1) l-100ng/ml。优选地，在5% CO2和37°C条件下进行细胞培养。优选地，将得到的植物和蛋白诱导性自体胰腺干细胞在细胞培养液C3中培养 9-12天形成胰岛，所述细胞培养液C3为含有天麻提取物50mg/ml、烟酰胺lOng/ml、碱性成纤维细胞生长因子lOng/ml、胰岛素lOng/ml、转化生长因子β lOng/ml、胰岛素样生长因子 110ng/ml 的 RPMI 1640。另一方面，本专利技术提供由上述方法制备的自体胰腺干细胞和自体胰岛。本专利技术还提供所述自体胰腺干细胞和自体胰岛的应用，优选地，本专利技术提供所述自体胰腺干细胞和自体胰岛在制备用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病药物中的应用；优选地，所述疾病为内分泌组织系统、神经组织系统、肝脏组织系统、肾脏组织系统等细胞、组织和器官的病理损害、创伤坏死和各种退行性变性；进一步优选地，所述疾病为胰腺疾病和糖尿病；更优选地，所述疾病为急慢性胰腺炎、慢性胰腺纤维化和胰岛素缺乏型糖尿病。ο又一方面，本专利技术提供用于使人的体细胞逆向分化的细胞培养液，其中所述培养液选自细胞培养液Cl、C2和C3，所述培养液Cl为RPMI 1640，并含有苦瓜提取物5_100mg/ ml、Y-27632 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林雄斌，
申请(专利权)人：林雄斌，
类型：发明
国别省市：
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