本发明专利技术涉及制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着体载体将重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁酸钠(NaBT)的存在下培养所述体细胞。本发明专利技术还涉及制备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法。另外，本发明专利技术还提供用于治疗范可尼贫血症的小分子化合物。
【技术实现步骤摘要】
制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法及其应 用
本专利技术涉及制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，本专利技术还涉及制 备用于移植治疗范可尼贫血症的造血干细胞、间充质干细胞或神经干细胞的方法，另外，本 专利技术还提供用于治疗范可尼贫血症的小分子化合物。
技术介绍
范可尼贫血症（Fanconi Anemia, FA)属于先天再生障碍性贫血，是一种严重的常 染色体隐性遗传疾病，其致病突变基因携带率约为1/180?1/300,发病率约为10?50/10 万，其临床特征性表现为进行性骨髓衰竭，多发性先天畸形以及恶性肿瘤易患性等重大致 死性症状。FA在世界各人群中均有发现，在某些种族人群中发病率异常增高，例如德系犹 太人和荷裔南非人中的FA基因携带率为1/90,而西班牙吉普赛人中的FA基因携带率高达 1/64?1/70。近年来随着对FA临床表现和发病机理的深入了解，我国FA患者的检出率逐 年增高，尤其是3-14岁儿童病例屡见报道，由于FA致残致死率极高，同时尚无便捷有效的 治疗手段，给患儿及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担，因此急需针对FA建立有效的诊断 和治疗技术，以及高效的药物筛选平台。 目前已发现15个FA相关致病突变基因（分别为FANCA、B、C、D1、D2、E、F、G、I、 J、L、M、N、0和P)，并且所有FA相关基因都参与一个重要的DNA修复途径（FA/BRCA途径）。 已有研究表明，通过在FA/BRCA通路缺陷的细胞内过表达相应的正常FA基因，可以纠正基 因缺陷，恢复细胞正常的生理功能，提示了未来可以通过基因治疗来治愈FA。然而，目前造 血干细胞移植是临床治疗FA的唯一手段，但同时造血干细胞的来源以及免疫排斥反应限 制了该治疗手段的临床应用。近年来，诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cell, iPSC)技术的出现和发展为疾病的药物筛选、基因治疗和细胞治疗提供了广阔前景。iPSC 是通过将特定转录因子（如0CT4, S0X2, KLF4, cMYC等）导入体细胞，使其转变成为的具备 胚胎干细胞特性的细胞，进一步定向分化为疾病累及细胞类型，为该类疾病药物筛选提供 具有显著优势的基于人类细胞的药物筛选平台。事实上，许多公司已经开始致力于建立 iPSC疾病模型用于药物发现研究。罗氏（Roche)与欧洲创新药物计划（IMI) 2012年联合 宣布推出StemBANCC，旨在以人诱导多能干细胞为研究工具，开发人类疾病模型，促进药物 开发，该计划研究包括糖尿病和老年痴呆症在内的一系列疾病。此外，Cellular Dynamics 和AstraZeneca公司也宣布将合作开发人类iPSC体外疾病模型，特别的是利用MyCell技 术将特定病人的细胞转化为体外疾病模型进行药物筛选。这种突破性的新技术将为人类疾 病机理研究和药物筛选实现新的跨越。另外，iPSC并非源于胚胎组织，不会受到伦理问题 的限制，结合现有的基因打靶技术对患者自体来源的iPSC进行基因突变的基因组原位矫 正，在基因水平清除内源性致病因素，为血液病的移植细胞治疗提供良好的移植材料，在个 性化治疗和转化医学中巨大的应用前景。 针对FA，目前可用雄激素，糖皮质激素和造血生长因子进行治疗，但是只能改善症 状，疗效难以持续，更无法根除。其原因在于目前范可尼病的疾病模型和药物筛选平台不 能满足进行药物筛选的需求。利用iPSC这一前沿技术，对范可尼病人体细胞进行重编程， 并定向分化为范可尼疾病累积的细胞类型，可建立新型范可尼药物筛选平台。另外，通过 IPSC技术平台，利用基因打靶技术对患者自体iPSC中的致病基因突变进行基因矫正，再 将其定向分化为无致病突变的正常造血干细胞，继而用于治疗血液系统疾病。因此，建立 高效的范可尼患者体细胞重编程体系至关重要。然而与其他遗传性贫血症相比，范可尼贫 血症患者的体细胞重编程研究具有更大的困难和挑战性。已有研究表明，FA涉及的FANC/ BRCA信号通路在发育和DNA损伤修复中发挥至关重要的作用，患者体细胞本身存在DNA损 伤和不稳定性，而重编程过程中又会进一步引发活性氧（ROS)增加、DNA断裂和细胞死亡 (Senescence)等细胞事件严重阻碍体细胞重编程的过程，因此针对FA患者携带致病突变 细胞的体细胞重编程研究困难重重，国内外鲜见成功实施的案例。 尽管近年来已有若干研究组利用不同策略获得FA患者来源的iPSC，但是仍然存 在各种问题和不足。例如2009年本专利专利技术人在首先过表达野生型FANCA基因对患者体 细胞系进行基因补偿之后，才利用慢病毒介导的体细胞重编程方法顺利对4例FANCA患者 体细胞（上皮细胞和角质细胞）完成重编程过程并获得患者自体iPSC。然而慢病毒载体 介导的重编程方法会导致外源基因发生不可控的基因组整合，不但会进一步加剧携带FA 致病基因突变细胞的DNA不稳定性，而且也无法实现安全的临床应用。此外，经过基因补偿 的细胞也无法作为疾病模型用于药物筛选。（A. Raya, I. Rodriguez-Piza, G. Guenechea, R. Vassena, S. Navarro, M. J. Barrero, A. Consiglio, M. Castella, P. Rio, E. Sleep, F. Gonzalez, G. Tiscornia, E. Garreta, T. Aasen, A. Veiga, I. M. Verma, J. Surralles, J. Bueren,J. C. Izpisua Belmonte, Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells, Nature. 2009,460:53-59)〇 2012 年 美国哈佛医学院的Daley研究组改进了体细胞重编程技术，利用低氧条件（Hypoxia)诱 导，同时结合慢病毒介导重编程因子表达，产生了 FA-A和FA-C患者自体iPSC。然而，该研 究同样利用慢病毒载体产生外源基因整合型iPSC，因而无法实现安全的临床应用。同时 尽管获得了携带FA致病突变的iPSC，但是该研究并未利用其开展可能的FA药物筛选工 作。（L. U. Muller, M. D. Milsom, C. E. Harris, R. Vyas, K. M. Brumme, K. Parmar, L. A. Moreau, A. Schambach, I. H. Park, ff. B. London, K. Strait, T. Schlaeger, A. L. Devine, E. Grassman, A. D ' Andrea, G. Q. Daley, D. A. Williams, Overcoming Reprogramming Resistance of Fanconi Anemia Cells. Blood. 2012, 119:5449-5457.)由此可见，现有报道产生的 FA 患者 来源的i本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着体载体将重编程因子OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁酸钠(NaBT)的存在下培养所述体细胞。
【技术特征摘要】
1. 一种制备范可尼贫血症患者自体诱导多能干细胞的方法，所述方法包括：利用附着 体载体将重编程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28的编码核酸以及针对人p53基因的 shRNA转入具有突变的范可尼贫血症相关基因的范可尼贫血症患者体细胞中；之后，在丁 酸钠（NaBT)的存在下培养所述体细胞。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述范可尼贫血症患者体细胞是范可尼贫血症患 者成纤维细胞。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述重编程因子0CT4、S0X2、KLF4、cMYC和LIN28 的编码核酸以及所述针对人P53基因的shRNA的核酸序列如SEQ. ID. NO: 1-6所示。4. 根据权利要求1所述的方法，其中丁酸钠的工作浓度为50-200 iiM。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘光慧，曲静，胡安·卡洛斯·伊斯毕华·贝尔蒙特，李默，铃木敬一郎，徐秀玲，张维琦，任若通，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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