导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库制造技术

本发明专利技术涉及医学领域的导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(-)DNA的产物，构建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染入爱德华综合征细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT重组子介导爱德华综合征体外研究细胞模型，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库
本专利技术涉及导入hTERT (端粒酶逆转录酶催化亚基)和SV40LT (猴肾病毒40大T抗原基因)重组子(SV40LT和hTERT介导)构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库，主要用于生殖健康研究领域，为爱德华综合症的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。
技术介绍
爱德华综合症，亦名18-三体症，即患者多了一条18号染色体。该综合征主要症状表现为患者头有后凸的枕部、眼裂狭小、耳朵畸形、耳位低下、小颌、胸骨短小等。由于患儿存在严重的智力低下伴多发畸形，50%在出生后2个月内死亡，可活至I年的不到10%，极个别可活到15岁。因缺乏有效的治疗手段，一旦患儿出生将会给家庭和社会带来极大的精神和经济负担，已严重影响我国的人口质量，已成为社会发展的沉重负担和可持续发展的严重障碍。 近年来，国内外将爱德华综合症列为三大重大出生缺陷之一，作为重点干预对象，并建立了相应的产前筛查和产前诊断方法。在《国民经济和社会发展的第十一个五年规划纲要》中强调，要加大爱德华综合症等出生缺陷的干预力度，以改善出生人口素质；在《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》中将爱德华综合症等出生缺陷的研究列为优先主题。 目前对爱德华综合症等出生缺陷的研究主要是针对遗传、生物、物理、化学因素与发病(率)的关系以及其早期筛查和诊断方面，如国外有大量的文献报道，18-三体等出生缺陷的发生与地区性、受孕时间、有害物接触史等环境因素呈显著相关；有国外文献报道，近亲婚配时所存在的两个相同隐性基因与生育爱德华综合症等出生缺陷患儿有关；Graaf、Rudnicka等报道孕妇的体重、吸烟习惯、孕产次与爱德华综合症筛查指标有关；另有国内学者报道孕妇吸烟、微量元素、心理因素、饮食、TORCH感染等与爱德华综合症等出生缺陷相关。 但是，由于没有理想的可在体外长期培养的、可用于发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库，就难以从细胞水平(以体外生长的活细胞替代人体或动物直接试验)在体外动态、实时研究爱德华综合症受物理、化学、生物、遗传等影响的基因突变、基因表达、功能改变、生理特性、生物传导等机制，从而严重限制了爱德华综合症的进一步研究。 国外文献报道，猴肾病毒40 (SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。Poulin DL、Kung AL和Sulli van CS等研究表明，SV40T抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率，永生化细胞在体外多次传代后，仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态，同时也能保留其原始细胞的许多分化表型，可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的建立，据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制。 但国外最近有研究发现,SV40Tag转染的细胞伴随着DNA损伤修复机制的丢失、核型的不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外，长期体外培养发现部分转染SV40Tag的细胞只是延长了寿命，或仅仅渡过了衰老期(MI期)，多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡，说明细胞并未获得永生化。同时SV40病毒具有致瘤性，与某些肿瘤的发生、发展有关，因此SV40Tag转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。 国外研究表明，导入外源性hTERT可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来已利用hTERT成功建立了某些细胞的永生化细胞系，基本保持染色体稳定、分化正常、接触抑制、无致瘤性等相对“正常”的生长特征。可以用于人类和动物某些种类的细胞模型的建立，对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性，从而研究其发病机制，具有重要的意义。在口腔医学领域，日本学者Kamata、Fujita和Fujii转染hTERT建立了永生化人牙龈成纤维细胞、牙周细胞、牙髓细胞系和牙囊细胞系，细胞群体倍增数达150次以上，细胞均表现原有的生物学特性，诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa等转染hTERT建立了人成牙骨质细胞系，细胞倍增达200次以上，细胞分化标志物如碱性磷酸酶、I型胶原等表达稳定。因研究工作的需要，几乎每种疾病都有各自的细胞模型。如糖尿病细胞模型、癌细胞细胞模型、转基因细胞模型、绝经期综合症细胞模型、子宫内膜细胞模型、癫痫细胞模型、电子细胞模型、酒精性痴呆细胞模型、脑水肿细胞模型。等等。 另有国外研究表明，人体组织细胞在体外培养时会在较短时间内死亡而无法传代，即在进入衰老期(Ml期)前就会死亡。但猴肾病毒40(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化，可使细胞渡过Ml期后继续存活、传代培养20-30代，然后细胞又会进入危机期(M2期)，细胞死亡率增加并伴染色体异常，分裂的细胞逐渐减少，绝大多数细胞发生死亡。而hTERT可以维持细胞染色体端粒的稳定，从而使细胞渡过危机期(M2期)，可继续存活、传代达100-300代以上。所以如果用SV40和hTERT同时转染人离体组织细胞建立永生化细胞系，那么SV40可以使细胞渡过Ml期，hTERT可以使细胞渡过M2期，比单独使用其中之一建立的细胞系更稳定、寿命更长。 但是，至今尚未见有关以猴肾病毒40大T抗原基因(SV40LT)和端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)同时导入细胞以建立永生细胞系并以此构建可用于在体外从细胞水平研究爱德华综合症发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道，也无法开展相关项目的研究。为了解决这一问题，本专利技术人提出了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是要提供导入hTERT(端粒酶逆转录酶催化亚基)和SV40LT(猴肾病毒40大T抗原基因)重组子(SV40LT和hTERT介导)构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库的方法，另一目的是为在体外从细胞水平研究爱德华综合症的发病机制提供SV40LT和hTERT介导的爱德华综合症细胞模型及其细胞库。 本专利技术的目的是这样实现的:以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-)DNA 的产物，构建 SV40LTag-pcDNA3.1(-)重组子；并以 Ligat1nMix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染入爱德华综合症组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT介导爱德华综合症体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。 本专利技术以PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳提纯SV40LT和hTERT，分别经基因载体pcDNA3.1(-)DNA和pLXSNneo以脂质体转染法导入爱德华综合症细胞而构建其细胞模型，其组织细胞用0.01%胶原酶II消化而不用常规的胰蛋白酶消化，以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮，减少了细胞壁的蛋白质被消化而本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生殖健康研究领域的导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体pcDNA3.1(‑)DNA的产物，构建SV40LT‑pcDNA3.1(‑)重组子；并以Ligation Mix连接经EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo‑hTERT和载体pLXSNneo的产物，构建pLXSNneo‑hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入爱德华综合症组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT重组子介导爱德华综合症体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。

【技术特征摘要】
1.一种用于生殖健康研究领域的导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库的方法，其主要特征是以T4DNA连接经BamHI酶切质粒SV40LTag DNA及载体 pcDNA3.1 (-) DNA 的产物，构建 SV40LT_pcDNA3.1 (-)重组子；并以 Ligat1n Mix 连接经EcoR I 和 Xho I 双酶切质粒 pCIneo-hTERT 和载体 pLXSNneo 的产物，构建 pLXSNneo-hTERT重组子，两重组子经感受态细胞扩增纯化和鉴定后以脂质体转染导入爱德华综合症组织细胞，经G418筛选含阳性重组子的细胞克隆并扩大培养，筛选细胞形态、生长曲线、染色体核型、裸鼠致瘤试验、转染细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达产物、免疫组织化学染色、细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或相近者作为SV40LT和hTERT重组子介导爱德华综合症体外研究细胞模型冻存于液氮中，为从细胞水平(替代人体或动物直接试验)在体外长期研究其发病机制奠定基础。2.根据权利要求1所述的导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是所指细胞模型为(I)细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮细胞样贴壁生长；(2)细胞的生长曲线如以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，在hepato ZYME-SFM无血清培养基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色体核型为47，XX，+18 ;*47，XY，+18 ;或相同于本发明采集的原代爱德华综合征细胞；(4)细胞不能在软琼脂内生长(形成克隆)；(5)细胞为非恶化细胞，裸鼠致瘤试验阴性；(6)细胞的DNA中同时整合了 SV40LT和hTERT基因，同时表达SV40LT和hTERT基因的mRNA产物；(7)细胞传代至第158代、培养至第8天时，呈对数生长、圆形、梭形、铺满瓶底，其细胞生长汇合率达95%以上，此后随着传代次数的增加，细胞生长变慢、变稀疏；(8)能反复冻溶、传代培养158代以上；(9)作为细胞模型用于体外从细胞水平研究爱德华综合征的病理机制；(10)可再生性地保存SV40LT和hTERT同时整合的爱德华综合征的遗传资源。3.根据权利要求1所述的导入hTERT和SV40LT重组子构建爱德华综合征细胞模型及其细胞库的方法，其特征是取自因其他实...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁炳焕，陈松长，李晓，舒静，张琳，黄荷凤，
申请(专利权)人：翁炳焕，
类型：发明
国别省市：浙江;33