一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞制造技术

本发明专利技术公开了一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有p63基因的慢病毒载体，所述的含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A>TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞，通过Q-PCR检测，其表达超过未转染的脂肪干细胞，改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞，达到快速有效的覆盖并修复创面的效果，本发明专利技术具有目的基因的转导效率高，能够比较方便快捷地实现目的基因的长期、稳定表达的特性；同时具有取材方便、生长迅速、自体组织无排异反应等优点。广泛应用于烧伤、整形外科领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞和基因工程的
具体的说，本专利技术涉及一种利用基因工程技术改造脂肪干细胞，影响其分化方向，并且这种改造后的改良式脂肪干细胞应用于表皮损伤修复中应用的

技术介绍
皮肤是人体或动物体最大的器官，覆盖全身，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，具有重要的生理功能。由于炎症、溃疡、烧伤等因素造成的皮肤损伤，严重的可危及生命。临床治疗方式有自体皮肤移植、异体皮肤移植以及异种皮肤移植。通过皮肤移植可以挽救病生命、并有助于创面愈合。表皮干细胞(ESC) 等干细胞移植治疗，在正常情况下，保证了皮肤的微环境和毛发生长，在组织损伤后参与其修复，同时其也是潜在的多能干细胞，完全可以利用其构建出具有完整表皮、真皮、皮肤附属器的功能健全的人工皮肤，实现创面由暂时性解剖修复向功能永久性修复的转变；当烧伤面积超过50％时，由于自体皮肤来源有限，因此在大多数情况下无法应用自体皮肤移植，而且自体皮肤移植给患者造成新的创伤，治疗费用巨大。尽管异体皮肤移植和异种皮肤移植可以克服以上问题，充当临时的伤面覆盖物，但是伴随移植会产生排斥反应和可能的一些移植疾病。脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs) 是一种具有多向分化潜能的干细胞，ADSCs 在体外稳定增殖且衰亡率低，在体内体外具有多向分化潜能，不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子。大面积深度烧伤以及慢性难愈性创面修复一直是临床治疗的难点。随着干细胞研究的开展和深入，体内外实验证明位于皮下脂肪组织内的脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）可以有效促进皮肤创面愈合。脂肪源性干细胞是一类与骨髓源性干细胞相类似的成体干细胞，具有多向分化潜能；同时脂肪源性干细胞具有少量组织可获取大量干细胞及取材方便等优点。而在细胞移植前，将目的基因转染干细胞，可增强细胞治疗的效果，因此细胞治疗与基因技术结合具有良好的应用前景。目前，在整形外科和烧伤外科的手术中，皮肤组织缺损的修复是常见问题。如烧伤、外伤或体表肿物切除等原因造成皮肤缺损，均需考虑患处皮肤组织的恢复问题。大面积的轻度烧伤或小面积的皮肤全层缺损，可以通过残存皮肤附件的细胞再生或临近皮肤的上皮细胞迁移而愈合；而深度烧伤创面或大面积的皮肤全层缺损，则需要采用自体皮肤移植或人工组织工程化皮肤进行修复。临床常用的修复方法存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤；而异体皮移植存在免疫排斥反应，且目前应用于临床的皮肤组织工程产品仍存在一定的免疫排斥反应、治疗效果欠佳等问题。因此如何能够快速覆盖并修复创面，是临床上急需且具有重要的研究价值和治疗前景的方向。Ramos等证实,将分选纯化后的脂肪干细胞植入裸鼠体内,可显著促进创面愈合,且具有表皮细胞再生的能力（Ramos TV,Wang T,Maki CB,et al．Adipose stem cell side population in the mouse. J Tissue Eng Regen Med . 2009）。有国内研究证明，转表皮生长因子基因的脂肪干细胞在体内成活并继续分化为表皮细胞,同时通过自分泌的途径协同促进创面的修复（王先成. EGF基因转染人脂肪干细胞体外诱导表皮细胞修复创面的实验研究[D].中国协和医科大学,2006.）。Koster认为, p63基因是上皮感应复层化指令的分子开关, 它在决定体表外胚层向表皮细胞系分化步骤中起至关重要的作用（Koster MI, Kim S, Mills AA, et a l. p63 is themolecu larsw itch forin it iation of an epithelia lstrat if ication program [ J ] . Genes Dev,2004, 18( 2 ) : 126-131.）。因此，根据以上研究，可以认为选取合适的刺激环境，能够有效调控脂肪干细胞分化的程度和方向，提高皮肤修复的质量。随着干细胞治疗技术在临床上的逐渐应用，越来越多的技术投向干细胞治疗大面积皮肤缺损的修复。体内动物实验已表明， 脂肪干细胞可成功的向成表皮细胞。如能实现脂肪干细胞的体外迅速扩增，那将为组织工程学研究注入新的生命力。目前国内外有关本领域的研究现状，目前临床上用于深度烧伤或大面积的皮肤缺损创面的修复方法，存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤、而异体皮移植及皮肤组织工程产品存在免疫排斥反应、治疗效果欠佳等问题。因此如何能够快速覆盖并修复创面，是临床上急需且具有重要的研究价值和治疗前景的方向。
技术实现思路
针对目前国内外在临床上用于深度烧伤或大面积的皮肤缺损创面的修复方法中客观存在着许多缺点，如造成供区的损伤、大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤、而异体皮移植及皮肤组织工程产品存在免疫排斥反应、治疗效果欠佳等现实问题的研究现状。本专利技术旨在于提供一种用于表皮损伤修复的改良式脂肪干细胞。本专利技术采用的主要技术方案：本专利技术通过提供一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有p63基因的慢病毒载体，所述的含p63基因的重组载体是pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP，利用慢病毒将p63基因转载至脂肪干细胞，通过Q-PCR和western-blot检测，均发现表皮干细胞特异性标志物p63，其表达均远超过未转染的脂肪干细胞，表明改良后的脂肪干细胞向表皮细胞的分化能力超过未转染的脂肪干细胞。验证了本专利技术制备的改良式脂肪干细胞拥有更好的向表皮细胞分化的能力，证实了制备获得改良式脂肪干细胞用于皮肤组织缺损修复具有显著突出的技术效果。本专利技术提供一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，改良式脂肪干细胞具体通过如下方法制备获得。（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定。（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定。（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：从GeneBank 中查寻TP63 （p63？）基因序列，设计引物，分别以attB1-Koza k-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Ga本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，其特征在于，具体通过如下方法制备获得：（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定；（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定；（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：从GeneBank 中查寻p63基因序列，设计引物，分别以attB1‑Koza k‑TP63‑F，attB2‑flag‑R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Gateway Technology构建pDown‑ TP63‑flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo‑EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体，通过菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒并测序；（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：所获得的pLV.EX3d.P/neo‑EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti‑TP63‑eGFP/Neo和Lenti ‑eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和免疫荧光检测；（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。...

【技术特征摘要】
1.一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，通过脂肪干细胞的分离及体外培养，构建了含有确定基因的慢病毒载体，利用慢病毒将确定基因转载至脂肪干细胞，通过慢病毒转染人脂肪干细胞，促进人脂肪干细胞向表皮分化，其特征在于，具体通过如下方法制备获得：
（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：无菌获取人脂肪组织并进行体外培养鉴定，以胶原酶振荡消化后离心收集细胞，常规传代及冻存,并对细胞进行细胞生长曲线及CD44、CD45、CD29、CD105表面标志物的流式细胞鉴定；
（2）脂肪干细胞的多向分化潜能鉴定：对所获人脂肪干细胞分别进行成脂和成骨分化鉴定，即分别以成脂和成骨诱导液诱导细胞，2周后分别对成脂细胞和成骨细胞进行油红染色和茜素红染色的鉴定；
（3） 构建含p63基因的慢病毒载体：从GeneBank 中查寻p63基因序列，设计引物，分别以attB1-Koza k-TP63-F，attB2-flag-R为引物，进行目的基因TP63的PCR 扩增；再利用Gateway Technology构建pDown- TP63-flag，最后利用Gateway Technology构建pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体，通过菌落PCR筛选阳性克隆，挑取阳性克隆质粒并测序；
（4）将上述制备的含p63基因的慢病毒载体转染到人脂肪干细胞：所获得的pLV.EX3d.P/neo-EF1A > TP63/flag>IRES/eGFP慢病毒载体转染到293FT细胞中，进行病毒包装，收集培养上清对病毒进行荧光表达观察及滴度测定；最后将Lenti-TP63-eGFP/Neo和Lenti -eGFP/Neo加入人脂肪干细胞，通过脂质体进行转导；荧光显微镜下观察转导效果，并进行PCR、WB和免疫荧光检测；
（5）利用p63基因的作用促使脂肪干细胞向表皮细胞分化。
2.如权利要求1所述的一种用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞，其特征在于，所述的用于皮肤组织缺损修复的改良式脂肪干细胞通过如下具体方法制备获得：
（1） 脂肪干细胞的分离及体外培养鉴定：脂肪组织剪成糜状，用PBS冲洗数遍，以0.1%胶原酶I置37℃摇床消化，离心30 min去上清，沉淀重悬于含10% 胎牛血清的DMEM 培养液中，移入培养皿中；隔天更换培养液；达到对数生长期后，用0.25%胰酶消化，按1：3的比例进行传代；
生长曲线的检测：取处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，洗涤离心，制备单细胞悬液，接种到24 孔板中；每天随机取4 孔细胞消化、记数，取其均值，连续7天，即可制备生长曲线；
流式检测脂肪干细胞表面标记：流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测；0. 25% 胰蛋白酶消化细胞, 1500r /分离心10 分钟, 在细胞沉淀中细胞数量为1* 106 ，分别加入FITC- CD105荧光抗体, PE - CD29荧光抗体,FITC-CD45,FITE-CD44荧光抗体各20ul , 4℃ 孵育30分钟, 再用PBS 缓冲液清洗2 遍, 最后用10%福尔马林固定细胞, 上流式细胞仪测定抗原的阳性率；
（2）脂肪干细胞定向分化及鉴定：
成脂分化：细胞贴壁100%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导72小时后，细胞内有小脂滴出现，约2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀；
成骨分化：取第3代细胞，加入间质干细胞成骨诱导液，基础培养液加10 mol／L地塞米松、10 mmmol／Lβ一甘油磷酸钠、50 mg／L抗坏血酸，诱导培养3天后，细胞体积增大，呈短梭形；诱导第7天，细胞呈多角形，胞质内细胞颗粒增多；14天，胞质内充满颗粒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯树梅，王玮，谭周，赖成霞，李甜，白生宾，郭琼，钟近洁，秦纹，
申请(专利权)人：新疆医科大学，冯树梅，
类型：发明
国别省市：新疆;65