一种海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）取海胆体腔液，经离心后取上清，获得体腔液上清；（2）以体腔液上清为样品进行非变性非还原的透析电泳；（3）透析电泳后再进行非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳；（4）根据非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳后海胆多功能肌动蛋白条带的特有颜色，对多功能肌动蛋白条带进行切胶，并通过凝胶破碎溶释法回收凝胶中的蛋白，得到纯化的海胆多功能肌动蛋白。本发明专利技术的优点在于：①纯化样品制备简单、快捷；②试剂和设备要求简单、易操作、步骤少、时间短；③纯化的样品具有高纯度和高蛋白活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质的分离纯化方法，具体涉及一种海胆体腔液中多功能肌动蛋白的分离纯化方法，属于棘皮动物生理学

技术介绍
海胆属于无脊椎动物的最高等类群―棘皮动物门，其生理活动的完成要依赖众多生理因子的参与。肌动蛋白（actin）是无脊椎动物体内细胞骨架的主要成分之一，参与多种细胞机能，包括细胞变形和收缩、细胞激化和细胞分裂等，同时也与损伤修复等免疫功能密切相关。酚氧化酶（PO）是无脊椎动物体内最重要的免疫因子之一，通过氧化酚类底物的反应，参与到病原异物的限制和隔离、伤口愈合、病原体的杀伤和抑制、调理作用、包囊作用和结节形成等多种免疫应答过程。此外，无脊椎动物PO还广泛应用于催化合成高分子材料（如无甲醛污染的新型树脂材料和人造板材、光电材料等）、工业和生活染色、造纸过程中的制浆漂白、环境中芳香类有机污染物的降解与生物修复、食品工业中的健康添加剂（增加葡萄酒和果汁等的稳定性和耐存性）以及生物检测等。亚铁氧化酶（ion oxidase）是无脊椎动物体内与铁代谢相关的氧化还原酶，主要参与铁的吸收和转运等代谢过程，而铁是体内诸多氧化还原酶的辅因子，因此亚铁氧化酶对无脊椎动物的生长和免疫至关重要。无脊椎动物体内的部分蛋白同时具有多种生物功能，这种现象称为“兼职”。同时具有肌动蛋白、酚氧化酶、亚铁氧化酶功能的蛋白（简称多功能肌动蛋白，multifunctional actin，MA）尚未在无脊椎动物中报道，是一种新蛋白。我们前期研究发现，在我国北方近海养殖的重要经济物种光棘球海胆Strongylocentrotus nudus和虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius中存在MA，具有极小分子量（约0.67kDa），且嗜热、耐高温（100℃）。海胆MA与单一PO功能的酶相比，具有以下潜在应用优点：①海胆MA同时具有PO功能和亚铁氧化酶功能，可以完成单一PO功能的酶所无法实现的一些高分子材料合成、染色、有机污染物降解和生物检测等；②海胆MA的极小分子量使该蛋白具有比其他酶更好的扩散性和渗透性，保证了该蛋白在工业和生活应用中具有更高的效率，同时也保证了该蛋白在基因工程表达上具有更高的效率；③海胆MA的嗜热、耐热特性保证了该蛋白具有更好的适应性。因此，开发一种可快速分离纯化海胆MA的方法，一方面对研究海胆的生长与免疫、促进海胆的健康养殖具有重要意义；另一方面对促进和开发海胆MA在工业和生活上的应用具有重要价值。目前分离纯化蛋白的方法主要有超滤、盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析、高效液相色谱等。针对某一蛋白的纯化往往需要上述2种或多种方法的联用，步骤多、操作复杂、时间长且不利于蛋白活性保持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、简便、高效的海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方法。本专利技术通过非变性非还原的透析电泳和凝胶电泳分离海胆中同时具有肌动蛋白、酚氧化酶、亚铁氧化酶功能的多功能肌动蛋白（MA），通过凝胶破碎溶释技术回收MA，通过液相色谱与串联质谱联用确定纯化蛋白的纯度与属性，最后通过生化方法确定MA的酶学特性。非变性非还原电泳可快速、简便、高效的分离具有不同生化特性的蛋白质，同时可以最大限度保持蛋白在天然状态下所具有的生物活性。凝胶破碎溶释技术（用匀浆器将胶条在超纯水中匀浆使胶条中的蛋白溶释到水中）可快速回收凝胶电泳中分离的特定蛋白条带。本专利技术的技术方案包括以下具体步骤：（1）取海胆体腔液，离心后取上清，获得体腔液上清；（2）将体腔液上清装入10kDa的透析袋中，封口后再将10kDa的透析袋放入0.1kDa的透析袋中，10kDa透析袋与0.1kDa透析袋之间填充电泳缓冲液后，封口；再将0.1kDa透析袋放入电泳缓冲液中进行非变性非还原的透析电泳；（3）非变性非还原透析电泳后以透析袋之间填充液体为样品进行非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳；（4）根据非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳后MA条带的特有颜色对MA条带进行切胶，通过匀浆器将胶条在超纯水中匀浆使胶条中的MA溶释到水中（凝胶破碎溶释），从而得到纯化的海胆MA。所述电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。所述非变性非还原透析电泳条件为30V恒压电泳1h。所述非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳条件为28mA恒流电泳7h。按所述的海胆MA分离纯化方法分离纯化光棘球海胆和虾夷马粪海胆中的MA，得到结果如下：虾夷马粪海胆和光棘球海胆MA在非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳条件下分子量与指示剂溴酚蓝的分子量非常接近，约0.67kDa，；液相色谱与串联质谱联用（Nano LC-MS/MS）检测结果显示，光棘球海胆MA的纯度为98.3%，虾夷马粪海胆MA的纯度为99.5%；PO活性检测结果显示，海胆MA和沸水浴处理10min的海胆MA均可氧化左旋多巴（L-DOPA）、多巴胺、邻苯二酚、对苯二酚等PO底物，但不能氧化酪氨酸，表明两种海胆MA具有漆酶型PO活性，且具有耐高温的特性；亚铁氧化酶活性检测结果显示，海胆MA和沸水浴处理10min的海胆MA均可氧化亚铁离子，表明两种海胆MA均具有亚铁氧化酶活性，且具有耐高温的特性。本专利技术的优点在于：①使用海胆体腔液上清为样品，样品制备简单、快捷；②通过非变性非还原电泳和凝胶破碎溶释实现海胆MA的纯化，纯化试剂和设备要求简单，纯化过程简单易行、步骤少、时间短（7小时）；③纯化的MA具有高纯度（98%以上），高蛋白活性（以多巴胺为底物时活力高于3900U/mg；以硫酸亚铁为底物时活力高于1200U/mg）。附图说明图1为本专利技术分离海胆MA的非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中，（A）为光棘球海胆MA凝胶电泳分离结果；（B）为虾夷马粪海胆MA凝胶电泳分离结果。图2为本专利技术纯化的海胆MA的PO活性检测图。图3为本专利技术纯化的海胆MA的亚铁氧化酶活性检测图。具体实施方式下面结合附图并通过具体实施例进一步说明本专利技术。实施例1：非变性非还原电泳-凝胶破碎溶释法分离纯化光棘球海胆MA（1）制备体腔液上清用灭菌注射器穿透光棘球海胆的围口膜抽取体腔液，离心(4℃，3500rpm，10min)，取上清作为体腔液上清。（2）以体腔液上清为样品进行非变性非还原的透析电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳①配制Tris-甘氨酸缓冲液（12.0g Tris, 60.0g甘氨酸, 4L 超纯水），预冷至4℃。②将体腔液上清装入10kDa透析袋中，用橡皮筋封口，再将10kDa透析袋放入0.1kDa透析袋中，10kDa透析袋与0.1kDa透析袋之间填充电泳缓冲液，将0.1kDa透析袋用透析夹封口，30V恒压电泳1h（4℃）后，快速取出透析袋之间的填充液，作为粗提MA暂存于4℃。③配制丙烯酰胺浓度为28%的分离胶和浓度为10%的浓缩胶，丙烯酰胺凝胶中不含有任何变性剂和还原剂。聚丙烯酰胺凝胶配方和规格如表1所示：表1聚丙烯酰胺凝胶配方和规格④将粗提MA与不含任何变性剂、还原剂和颜色指示剂的电泳上样缓冲液按10:1（v本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）取海胆体腔液，经离心后取上清，获得体腔液上清；（2）将体腔液上清装入10kDa的透析袋中，封口后再将10kDa的透析袋放入0.1kDa的透析袋中，10kDa透析袋与0.1kDa透析袋之间填充电泳缓冲液后，封口；再将0.1kDa透析袋放入电泳缓冲液中进行非变性非还原的透析电泳；（3）透析电泳后以透析袋之间填充液体为样品进行非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳；（4）根据海胆多功能肌动蛋白非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳后的特有颜色，对多功能肌动蛋白条带进行切胶，并通过凝胶破碎溶释法回收凝胶中的蛋白，从而得到纯化的海胆多功能肌动蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）取海胆体腔液，经离心后取上清，获得体腔液上清；（2）将体腔液上清装入10kDa的透析袋中，封口后再将10kDa的透析袋放入0.1kDa的透析袋中，10kDa透析袋与0.1kDa透析袋之间填充电泳缓冲液后，封口；再将0.1kDa透析袋放入电泳缓冲液中进行非变性非还原的透析电泳；（3）透析电泳后以透析袋之间填充液体为样品进行非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳；（4）根据海胆多功能肌动蛋白非变性非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳后的特有颜色，对多功能肌动蛋白条带进行切胶，并通过凝胶破碎溶释法回收凝胶中的蛋白，从而得到纯化的海胆多功能肌动蛋白。
2.根据权利要求1所述的海胆多功能肌动蛋白的分离纯化方...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋经伟，董颖，陈仲，高杉，关晓燕，姜北，周遵春，
申请(专利权)人：辽宁省海洋水产科学研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21