一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法。本发明专利技术提供的从抗虫棉种子中纯化Bt?Cry1Ac蛋白的方法，包括如下步骤：（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9?CGMCC?No.5162分泌产生的单克隆抗体。本发明专利技术具有以下优点：（1）简化了纯化流程，降低了纯化成本；（2）缩短了纯化时间，减少了目的蛋白损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化学领域，具体涉及。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)在形成芽孢的过程中会产生一种伴胞晶体，该晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，被称为杀虫晶体蛋白(ICP, Insecticidal Crystal Protein),又称 Bt 毒蛋白。Bt毒蛋白可毒杀鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。虽然人畜并非Bt毒蛋白的天然靶向物种，但围绕转Bt基因作物是否对人畜和环境有害的争论从未停止。目前研究所使用的Bt毒蛋白绝大多数来自于原核表达，由于外源基因在植物体内的表达产物可能存在复杂的翻译后修饰过程，可能会导致蛋白质在性质和功能上发生变化，所以使用原核表达的Bt毒蛋白并不能完全真实地反映转Bt基因作物的危害。Bt CrylAc蛋白为Bt毒蛋白中的一种，其氨基酸序列如序列表的序列I所示，基因序列如序列表的序列2所示。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤:(I)将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；(2)将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；(3)溶解步骤(2)得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；(4)将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌产生的单克隆抗体。杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.5162。所述步骤(I)中，可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。所述步骤(I)中，所述溶液甲的制备方法具体如下:将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用PH10.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取(提取温度具体可为4°C，提取时间具体可为4小时；提取过程中可用磁力搅拌器搅拌，以增加提取效率)，离心(离心条件具体可为:40C UOOOOrpm离心20分钟)后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲。步骤(I)中:Bt毒蛋白是碱溶性蛋白，使用碱性溶液进行可溶性总蛋白的提取能提高Bt毒蛋白的提取效率； 可溶性总蛋白的提取过程中会使种子内部的蛋白水解酶释放到溶液中，在4°C下进行可溶性总蛋白的提取，可以使蛋白酶的活性降低，提高Bt毒蛋白的提取效率；可溶性总蛋白的提取过程中使用磁力搅拌，可以混匀提取体系，防止局部蛋白浓度过高而降低蛋白质进入溶液中的速率。所述步骤(2)中，所述“进行60%饱和度的硫酸铵沉淀”的实现方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸铵并使其达到60%饱和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的时间具体可为40分钟。所述冰浴放置过程中可用磁力搅拌器搅拌。所述离心的参数具体可为:4°C、7000rpm离心20分钟。步骤(2)中:抗体对蛋白质抗原的识别依赖于蛋白质一定的空间构象,温度较高容易使蛋白质的空间构象发生改变，从而导致不能被抗体识别，在冰浴中进行硫酸铵沉淀可以避免Bt毒蛋白的构象发生改变，减少操作造成的Bt毒蛋白损失；硫酸铵沉淀的过程中使用磁力搅拌，可以混匀沉淀体系，使硫酸铵浓度迅速均匀化。所述步骤(3)中，可用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。步骤(3)中:使用去离子水和IM Tris水溶液溶解沉淀，去离子水中含有极微量离子，能减少盐溶性杂蛋白的溶解，使用Tris是促使溶液迅速变为碱性，有利于Bt毒蛋白的溶解。所述步骤(4)中，所述免疫亲和层析的步骤可如下:①将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；②用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液。所述免疫亲和层析的填充料可为CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具体 可为pH2.5、0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述洗脱液具体可为含体积比为50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述免疫亲和层析过程中，具体可采用4转/分的上样流速、清洗流速和洗脱流速。所述步骤②中具体可用2倍上样体积的清洗液清洗柱子。所述步骤③中具体可用3倍体积的洗脱液进行洗脱。所述步骤③中具体可按Iml每管收集过柱后的洗脱液。步骤(4)中:免疫亲和层析的原理是利用抗原与抗体特异性识别并结合的特性，使抗原吸附到结合有抗体的填料上，杂蛋白由于不能与抗体结合而随液流流出亲和层析柱，因而使目的蛋白与杂蛋白分离，再使用较为苛刻的条件破坏抗原抗体的结合力而使抗原从结合有抗体的填料上分离下来，从而达到纯化目的蛋白的目的；较慢的上样流速是为了使样品中的Bt毒蛋白能充分吸附到免疫亲和层析柱上，较慢的清洗流速是为了充分地破坏杂蛋白与抗体间的作用力，去除杂蛋白，较慢的洗脱流速是为了充分地破坏Bt毒蛋白与抗体间的作用力，使Bt毒蛋白从免疫亲和层析柱上解吸附。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。低pH条件下,蛋白质的构象会发生改变,也更易降解,使用IM Tris水溶液中和过柱后洗脱液，可以减少Bt毒蛋白的在低pH条件下地降解，并有助于其保持并恢复正常的构象。PBS缓冲液中含有足够的盐离子，可以有效地帮助Bt毒蛋白在表面形成水化层，从而有利于Bt毒蛋白在溶液中的稳定。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5，然后检测其中是否含有Bt毒蛋白，最 后将含有Bt毒蛋白的溶液进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶标板；(幻在步骤(i)的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗脱液，37°C温育30min ；(iii)在步骤(ii)的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的抗Bt CrylAc蛋白单克隆抗体，37°C温育30min ；(iv)向步骤(iii)的酶标板中加入底物缓冲液,室温反应15min后终止反应；(V )在 492nm 下测定 OD 值；(vi)将对照棉花本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤：（1）将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；（2）将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；（3）溶解步骤（2）得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；（4）将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt?Cry1Ab/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC?No.5162分泌产生的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种从抗虫棉种子中纯化Bt毒蛋白的方法，包括如下步骤: (1)将抗虫棉种子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲； (2)将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀； (3)溶解步骤(2)得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙； (4)将所述溶液乙进行免疫亲和层析,收集与抗BtCrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌产生的单克隆抗体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(I)中，采用pH10.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，张亮，曹振，郭素琴，谭桂玉，南铁贵，李召虎，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：