杀虫蛋白质、其编码基因及用途制造技术

本发明专利技术涉及一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，杀虫蛋白质包括：（a）如SEQ?ID?NO:2或其第1-640位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由（a）衍生的蛋白质；或（c）通过包含SEQ?ID?NO:1的第1-1920位核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质；或（d）通过包含具有在严格条件下与SEQ?ID?NO:1的第1-1920位核苷酸序列杂交的互补序列的核酸分子的表达产生的蛋白质；或（e）通过包含与（d）的核苷酸序列同类编码的核酸分子的表达产生的蛋白质。本发明专利技术杀虫蛋白质表达量高且对昆虫害虫的毒力强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，特别是涉及一种改造的PIC9杀虫蛋白质、其编码基因及用途。
技术介绍
植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制齐U，但二者在实际应用中都具有局限性化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究 发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。PIC9杀虫蛋白是一种伴孢不溶性晶体蛋白。PIC9蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性PH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。每年因植物虫害造成的粮食损失巨大，例如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾或棉铃虫等。目前未发现PIC9杀虫蛋白在植物中的表达水平和毒力的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杀虫蛋白质、其编码基因及用途，所述PIC9杀虫蛋白在植物中(尤其为玉米)具有较高的表达量和毒力。为实现上述目的，本专利技术提供了一种杀虫蛋白质，包括(a)如SEQ ID NO:2所示的第1-640位氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(c )在(a)或(b )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质；或(d)通过包含SEQ ID NO: I的第1-1920位核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质；或(e)通过包含核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质，所述核苷酸序列具有在严格条件下与SEQ ID NO: I的第1-1920位核苷酸序列杂交的互补序列；或(f)通过包含核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质，所述核苷酸序列与(e)的核苷酸序列同类编码。所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。为实现上述目的，本专利技术提供了一种杀虫基因，包括(a)编码如SEQ ID NO:2所示的第1_640位氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列；或(b)编码如SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列；或(c)编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列为在(a)或(b)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质；或(d)具有SEQ ID NO: I的第1-1920位所示的核苷酸序列；或(e)在严格条件下与(d)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的 核苷酸序列；或(f)与(e)的核苷酸序列同类编码。所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述杀虫基因。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的重组载体。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种包含所述杀虫基因或所述杀虫基因的转基因宿主生物，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种产生杀虫蛋白质的方法，包括获得所述转基因宿主生物的细胞；在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；回收所述杀虫蛋白质。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括将所述表达盒在植物中与至少一种不同于所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫蛋白质一起表达。进一步地，所述第二种杀虫蛋白质为Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。在本专利技术中，PIC9杀虫蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第I亲本)可以通过遗传工程操作表达PIC9杀虫蛋白，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Vip类杀虫蛋白质。通过第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种产生抗虫植物的方法，包括将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种由包含所述杀虫基因的核苷酸序列编码的杂合杀虫蛋白质。进一步地，所述杂合杀虫蛋白质是由如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列编码的。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括使昆虫害虫与抑制量的所述杀虫蛋白质或由所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白质或所述杂合杀虫蛋白质接触。优选地，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本专利技术中为将·外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。本专利技术中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。本专利技术中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。本专利技术中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杀虫蛋白质，其特征在于，包括：（a）如SEQ？ID？NO:2所示的第1？640位氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）如SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（c）在（a）或（b）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有杀虫活性的由（a）或（b）衍生的蛋白质；或（d）通过包含SEQ？ID？NO:1的第1？1920位核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质；或（e）通过包含核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质，所述核苷酸序列具有在严格条件下与SEQ？ID？NO:1的第1？1920位核苷酸序列杂交的互补序列；或（f）通过包含核苷酸序列的核酸分子的表达产生的蛋白质，所述核苷酸序列与（e）的核苷酸序列同类编码。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱红，庞洁，牛瑞琪，牛丽红，高超，苗猛猛，杨东海，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心，
类型：发明
国别省市：