杀虫基因及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种杀虫基因及其用途，所述杀虫基因的核苷酸序列包括：(a)具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ?ID?NO:2；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。本发明专利技术杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，尤其是玉米和水稻，不仅显著提高了PIC2-01杀虫蛋白的表达量和稳定性，而且还显著增强了PIC2-01杀虫蛋白对昆虫害虫的毒力，尤其是鳞翅目昆虫害虫。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种杀虫基因及其用途，特别是涉及一种改造的PIC2-01杀虫基因及其用途。
技术介绍
植物虫害是导致农作物损失的主要因素，给农民造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了防治植物虫害，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫制齐U，但二者在实际应用中都具有局限性:化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫制剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。为了解决化学杀虫剂和生物杀虫制剂在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。PIC2杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是不溶性伴孢结晶蛋白。PIC2蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。玉米和水稻是世界上分布广泛的粮食作物，每年因植物虫害造成的粮食损失巨大，例如小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、东方黏虫或二化螟等。已证明PIC2蛋白可以抵挡多种鳞翅目昆虫害虫(如玉米螟、棉铃虫等)的侵害，且目前鲜有依据植物的偏好密码子对PIC2杀虫蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列进行改造的研究，尤其是针对单子叶植物(如玉米)以提高其在植物中的表达水平和效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杀虫基因及其用途，其是依据玉米的偏好密码子而进行的优化改造，使得PIC2-01杀虫蛋白在植物中(尤其为玉米和水稻)具有较高的表达量和毒力。为实现上述目的，本专利技术提供了一种杀虫基因，其核苷酸序列包括:(a)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ ID NO: 2 ;或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。 所述严格条件可为在6 X SSC (柠檬酸钠)、0.5%SDS (十二烷基硫酸钠)溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述杀虫基因。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的重组载体。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种包含所述杀虫基因或所述表达盒的转基因宿主生物，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。进一步地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种产生杀虫蛋白质的方法，包括:获得所述转基因宿主生物的细胞；在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞；回收所述杀虫蛋白质。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于增加昆虫靶范围的方法，包括:将所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀虫核苷酸一起表达。进一步地，所述第二种杀虫核苷酸可以编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。可选择地所述第二种杀虫核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。在本专利技术中，PIC2-01杀虫蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达 可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第I亲本)可以通过遗传工程操作表达PIC2-01杀虫蛋白，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第I亲本和第2亲本杂交获得表达引入第I亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭特定基因的表达。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种产生抗虫植物的方法，包括:将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种用于保护植物免受由昆虫害虫引起的损伤的方法，包括:将所述杀虫基因或所述表达盒或所述重组载体导入植物，使导入后的植物产生足够保护其免受昆虫害虫侵害量的杀虫蛋白质。优选地，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。将所述的杀虫基因或所述的表达盒或所述的重组载体导入植物，在本专利技术中为将外源DNA导入植物细胞，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。为实现上述目的，本专利技术还提供了一种控制昆虫害虫的方法，包括:使昆虫害虫与抑制量的由所述杀虫基因编码的昆虫抑制性蛋白接触。优选地，所述昆虫害虫是鳞翅目昆虫害虫。本专利技术中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。本专利技术中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本专利技术的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了 DNA的其它互补链。这样，本专利技术包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本专利技术还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA (肽核酸)。本专利技术中核酸分子或其片段在严格条件下与本专利技术杀虫基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本专利技术杀虫基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本专利技术中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本专利技术中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具 有“互补性”本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杀虫基因，其特征在于，其核苷酸序列包括：(a)具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ?ID?NO:2；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种杀虫基因，其特征在于，其核苷酸序列包括: (a)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQID NO: 2 ;或 (c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。2.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求1所述杀虫基因。3.一种包含权利要求1所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒的重组载体。4.一种包含权利要求1所述杀虫基因或权利要求2所述表达盒的转基因宿主生物，其特征在于，包括植物细胞、动物细胞、细菌、酵母、杆状病毒、线虫或藻类。5.根据权利要求4所述转基因宿主生物，其特征在于，所述植物为玉米、大豆、棉花、水稻或小麦。6.—种产生杀虫蛋白质的方法，其特征在于，包括: 获得权利要求4或5所述转基因宿主生物的细胞； 在允许产生杀虫蛋白质的条件下培养所述转基因宿主生物的细胞； 回收所述杀虫蛋白质。7.一种用于增加昆虫靶范围的方法，其特征在于，包括:将权利要求1所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或权利要求2所述表达盒编码的杀虫蛋白质在植物中与至少一种不同于权利要求1所述杀虫基因编码的杀虫蛋白质或权利要求2所述表达盒编码的杀虫蛋白质的第二种杀...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁德荣，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司生物技术中心，
类型：发明
国别省市：