一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法技术

本发明专利技术公开了一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品分类，分别剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)dd水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；(5)dd水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；(7)dd水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸湿，液氮研磨；(9)提取：200μL of7M尿素，2M硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4，室温，过夜消化；.(10)纯化步骤。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品分类，分别剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)dd水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；(5)dd水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；(7)dd水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸湿，液氮研磨；(9)提取：200μL?of7M尿素，2M硫脲，50mM?Tris，and50mM?TCEP，pH4，室温，过夜消化；.(10)纯化步骤。【专利说明】
本专利技术属于化学
，涉及。
技术介绍
毛发蛋白主要是角蛋白组成，而角蛋白分子间主要是靠二硫键形成稳定的空间网 状结构。溶解毛发中的蛋白主要是使二硫键（-s-s)断裂，此外蛋白质分子间高密度的氢 键、盐式键等也不能忽视。目前国内现有蛋白质提取技术时间相对较长，程序繁琐，不利于 实验室高通量大规模地应用，制备角蛋白主要有一下几种方法：1)机械法，有高压水解法、 膨化法、挤压法和挤出法。主要是加热（100?200°C )、加压（0. 294?0. 98MPa)的方法使 角蛋白内部的二硫键断裂水解，从而使其变为可溶、易消化的多肽混合物。2)化学法，有酸 碱法、还原法、氧化法和金属盐法。机械法不仅能够让二硫键发生断裂，还能让多肽链发生 断裂，得率不高，不利于对蛋白质组成份分析。化学法中的酸碱法提取过程中会产生碱性废 水和废酸的蒸汽，污染环境，并对人体有害。近年人们更多地采用还原法制备可溶性角蛋白 研究蛋白质。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种快速提取纯化检测毛样蛋 白方法。其具体技术方案为： ，包括以下步骤： (1)样品分类，分别剪成小段； (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干； (3) dd 水 60°C 清洗 5min，吸干； (4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干； (5)超纯水60°C清洗5min，吸干； (6) 0· 1M 甲醇碱 Κ0Η，室温 30min，吸干； (7)超纯水60°C清洗5min，吸干； (8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎； (9)提取：取粉末 200mg 加入 500yL of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振荡消化过夜；. (10)纯化步骤 1).取0. 1ml消化液至2ml离心管，加入0. 4ml甲醇，涡旋混匀； 2) ·再加入0· 2ml氯仿，涡旋混匀； 3)再加入0. 3ml超纯水，剧烈震荡，10000g离心，lmin ; 4).小心弃掉上清； 5).加入0· 3ml甲醇，涡旋混匀，10000g，离心2min ; 6).弃掉上清，倒置室温干燥，备下一步使用； 7). 50-100微升IX蛋白上样缓冲液溶解，沸水浴5min，备SDS-PAGE跑胶使用。 进一步优选，步骤（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2 : 1。 与现有技术相比，本专利技术的有益效果为： 本专利技术采用的"壬基酚聚氧乙烯（9)醚"非离子表面活性剂，能够有效的清洗毛样 表面污渍，再用二氯甲烷和乙醇祛除内部脂质，再用甲醇碱祛除结合脂肪酸。通过物理粉 碎，采用还原法，Tris (2_carboxyethyl)phosphine (TCEP)还原角蛋白二硫键，再利用利用 高浓度尿素和硫脲使其蛋白膨胀溶解，最终得到可溶性蛋白质，该方法反应活性温和易溶、 毒性小，而更容易操作和应用后续蛋白质谱分析。 【专利附图】【附图说明】 图1为SDS-PAGE检测结果，其中：M为预染蛋白marker(14. 4-120KD) ;1为陕北白 绒山羊A的毛样，2、3为陕北白绒山羊A的绒毛羊；4为陕北白绒山羊B的毛样，5、6为陕北 白绒山羊B的绒毛羊。 【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。 ，包括以下步骤： (1)样品分类，分别剪成小段； (2)0.15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚601：清洗201^11，吸干； (3) dd 水 60°C清洗 5min，吸干； (4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干； (5)超纯水60°C清洗5min，吸干； (6) 0· 1M 甲醇碱 Κ0Η，室温 30min，吸干； (7)超纯水60°C清洗5min，吸干； (8)磨碎：用水将毛绒浸湿后在液氮中研磨粉碎； (9)提取：取粉末 200mg 加入 500 μ L of7M 尿素、2M硫脲、50mM Tris 和 50mM TCEP 溶液（pH4)，37°C，振荡消化过夜；. (10)纯化步骤 1).取0. 1ml消化液至2ml离心管，加入0. 4ml甲醇，涡旋混匀； 2).再加入0. 2ml氯仿，涡旋混匀； 3)再加入0. 3ml超纯水，剧烈震荡，10000g离心，lmin ; 4).小心弃掉上清； 5) ·加入0· 3ml甲醇，涡旋混匀，10000g，离心2min ; 6).弃掉上清，倒置室温干燥，备下一步使用； 7). 50-100微升IX蛋白上样缓冲液溶解，沸水浴5min，备SDS-PAGE跑胶使用。 步骤（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗的体积比为V/V2 : 1。 将得到的胶条送至华大公司测序得到如下结果： 陕北白绒山羊A :毛样检测出205种毛蛋白，绒样检测出252种毛蛋白。【权利要求】1. ，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品分类，分别剪成小段； (2) 0. 15%壬基酚聚氧乙烯（9)醚60°C清洗20min，吸干； (3) 超纯水6(TC清洗5min，吸干； (4) 二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干； (5) 超纯水60°C清洗5min，吸干； (6) 0· 1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干； (7) 超纯水60°C清洗5min，吸干； (8) 磨碎：用水浸湿，液氮研磨； (9) 提取：200yL of7M 尿素，2M 硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4,室温，过夜消 化;· (10) 纯化步骤 1) .向0. lml蛋白溶液中加入0.4ml甲醇，涡旋，瞬时离心，10s ; 2) .再加入0. 2ml氯仿，涡旋，瞬时离心，10s ; 3) 再加入0. 3ml ddH20,剧烈震荡，瞬时离心，lmin ; 4) .小心弃掉上清，用枪吸； 5) .加入0.3ml甲醇，润旋，瞬时离心，2min，沉淀； 6) .弃掉上清，倒置室温干燥，干燥完成后保存备用； 7) . 50-100微升5 % SDS溶解蛋白，不容物可用蛋白上样buffer溶解，备用，跑 SDS-PAGE。2. 快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，步骤（4)中所述二氯甲烷和乙醇洗 的体积比为V/V2 : 1。【文档编号】G01N1/28GK10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速提取纯化检测毛样蛋白方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品分类，分别剪成小段；(2)0.15％壬基酚聚氧乙烯(9)醚60℃清洗20min，吸干；(3)超纯水60℃清洗5min，吸干；(4)二氯甲烷和乙醇洗常温清洗20min，吸干；(5)超纯水60℃清洗5min，吸干；(6)0.1M甲醇碱KOH，室温30min，吸干；(7)超纯水60℃清洗5min，吸干；(8)磨碎：用水浸湿，液氮研磨；(9)提取：200μL of7M尿素，2M硫脲，50mM Tris，and50mM TCEP，pH4，室温，过夜消化；.(10)纯化步骤1).向0.1ml蛋白溶液中加入0.4ml甲醇，涡旋，瞬时离心，10s；2).再加入0.2ml氯仿，涡旋，瞬时离心，10s；3)再加入0.3ml ddH2O，剧烈震荡，瞬时离心，1min；4).小心弃掉上清，用枪吸；5).加入0.3ml甲醇，涡旋，瞬时离心，2min，沉淀；6).弃掉上清，倒置室温干燥，干燥完成后保存备用；7).50‑100微升5％SDS溶解蛋白，不容物可用蛋白上样buffer溶解，备用，跑SDS‑PAGE。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王小龙，陈玉林，周光现，牛怡源，师丙波，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61