从人多能干细胞产生心肌细胞系细胞制造技术

本发明专利技术提供了人心肌细胞系细胞群。通过使多能干细胞的培养物体外分化，然后收集具有某些表型特征的细胞而获得这些细胞。此分化细胞具有心肌细胞的特征性细胞表面标志和形态标志，并且它们的一部分经历了自发性的周期性收缩，可获得高度富集的此种心肌细胞群和它们的复制性前体细胞，适用于各种应用，如心脏病的药物筛选和治疗。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总地涉及胚胎细胞及其分化的细胞生物学领域。更具体说，本专利技术采用特殊培养条件和筛选技术提供了可控制的人多能干细胞分化成为心肌细胞及其前体细胞。相关申请参考本申请要求2001年7月12日提交的美国前专利申请60/305,087和2001年9月10日提交的60/322695的优先权。在美国和其它管辖范围内允许将此优先权文件以及国际专利出版物WO 01/51616的全部内容纳入本文参考文献中。背景心脏病是西方世界最受关注的严重疾病之一。据估计6100万美国人(几乎每5位男性和女性有1人)患有1种或多种心血管疾病(全国健康和营养研究调查III，1988-94，疾病控制中心和美国心脏病协会)。广泛散播的疾病包括冠心病(1240万)、先天性心血管缺陷(100万)和充血性心力衰竭(4700万)。对于再生医学研究的主要挑战是开发能帮助在这些疾病中重建心脏功能的细胞组合物。迄今已进行的大多数研究工作采用啮齿动物模型开发的各种类型干细胞。Maltsev、Wobus等(Mechauisms Dev.4441，1993)报道了小鼠的胚胎干细胞(ES)可通过胚胎样聚集体体外分化为自发搏动的心肌细胞，Wobus等(Ann.N.Y.Acad.Sci，27460，1995)报道小鼠多能ES细胞复现了心肌细胞从未定型的胚胎细胞发育成为心肌(层)特有的细胞表型。可接种胎胚样小体、培养、分离并用免疫荧光和电生理研究测定。据报道此细胞可表达心脏特异性基因和所有主要的心脏特异性离子通道。Wobus等(J.Mol.Cell.Cardiol.291525，1997)报道视黄酸可加速ES细胞的心脏分化并增加心室心肌细胞的发育。该研究所用细胞克隆转染后表达了在MLC-2V启动子控制下的β-半乳糖苷酶。Kolossov等(J.Cell.Biol.1432045，1988)报道采用含有在心源性α-肌动蛋白启动子控制下的绿荧光蛋白质载体，分离得到小鼠ES细胞衍生的心前体细胞。膜片钳(Patch clamp)和Ca++成象提示L型钙通道的表达起始于胚胎样小体发育的第7天。Narifa等(Development1223755，1996)报道GATA-4缺陷小鼠的ES细胞能分化成心肌细胞。在嵌合小鼠的心内膜、心肌层和心外膜中发现了GATA-4缺陷性细胞。这些作者提出其它GATA蛋白质可能补偿GATA-4的缺乏。美国专利6,015,671(Field)和Klug等(J.Clin.Invest.98216，1996)报道用基因工程方法从分化性小鼠ES细胞选出的心肌细胞形成了稳定的心内移植物。用α-心肌球蛋白重链(MHC)启动子驱动氨基葡糖苷磷酸转移酶或neor，和用抗菌素G418筛选，从分化性小鼠ES细胞选出了这些细胞，将其移植入成年营养障碍性小鼠的心脏内，据报告移植后长达7周都发现标记的心肌细胞。国际专利出版物WO00/78119(Field等)提出一种通过增加细胞周期蛋白D2活性来提高心肌细胞增殖潜能的方法。Doevendans等(J.Mol.Cell Cardiol.32839，2000)提出漂浮的胚胎样小体中，心肌细胞的分化相当于胚胎心肌细胞。啮齿动物干细胞产生的心肌细胞据报道可分化成为心室肌细胞并具有钠钙和钾流。Muller等(FASEB J.142540，2000)报道从用心室特异性2.1Kb肌球蛋白轻链2V启动子和CMV增强子控制下的绿荧光蛋白转染的小鼠ES细胞中，分离得到心室样心肌细胞。电生理研究提示存在心室表型但无起搏点样的心肌细胞。Gryschenko等(Pflugers Arch 439798，2000)研究了小鼠ES细胞产生的心肌细胞中的输出电流。早期ES衍生心肌细胞中的优势再极化电流，是4-氨基吡啶敏感性短暂输出电流。这些作者的结论是在早期心肌中，这些暂短的输出电流在控制心电活动中起着重要作用。国际专利出版物WO 92/13066(Loyola大学)报道从用致癌基因V-myc或V-ras进行基因修饰的胎胚物质，构建了大鼠心肌细胞系。美国专利6,099,832和6,110,459(Mickle等，Geugyme)报道采用成年心肌细胞、儿童心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞或骨骼肌细胞的不同组合改进了大鼠模型的心脏功能。美国专利5,919,449(Diacrin)报道采用猪心肌细胞治疗异种个体的心功能不全，细胞获自妊娠20-30天的猪胚。Makino等(J.Clin.Invest.103697，1999)和K.Fukuda(Artificial Orgoms251978，2001)从中胚层干细胞产生了新生的心肌细胞进行心血管组织工程改造，从骨髓基质产生了心肌细胞系并培养了4个月以上。为了诱导细胞分化用5-氮脱氧胞嘧啶处理细胞24小时，引起30％的细胞形成肌管样结构，获得心肌细胞标志并开始搏动。大多数已建立的心肌细胞系获自动物组织，尚未建立可批准广泛用于人类心脏治疗的心肌细胞系。Liechty等(Nature Med 61282，2000)报道了人中胚层干细胞的移植，并证明绵羊子宫内移植后发生了部位特异性分化。据报道移植后移植物长期存活时间长达13个月并如期望的发育成免疫活性。国际专利出版物WO 01/22978提出一种方法来改进心力衰竭病人的心脏功能，该方法包括将自身骨髓基质细胞移植入心肌层产生新的肌纤维。国际专利出版物WO 99/49105(Zymogenetics)提出分离人的非粘附多能心肌干细胞。悬浮此心肌细胞进行密度梯度离心，培养并测定其心肌特异性标志。经过增殖和分化，所述细胞系产生的后代细胞为成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、角质形成细胞或骨细胞或软骨细胞。尚不清楚这些专利中例举的细胞制品是否可以大量生产提供给市场作为再生心脏功能的治疗性复合物。治疗心脏病的新生细胞的一种更具前景的来源是获自胚胎组织的人多能干细胞。Thomson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)首先用恒河猴或狨猴作模型成功地培养出灵长类动物的胚胎干细胞，他们随后从人的胚泡产生了人的胚胎干(hES)细胞系(Science 828114，1998)Gearhart和同事从胚胎卵巢组织产生了人胚胎种系(hES)细胞系(Shambloot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998)国际专利出版物WO 00/70021提出分化的人胚胎样细胞和从hES细胞产生它们的方法。国际专利出版物WO 01/53465概述了从hEG细胞制备胚胎样小体衍生的细胞。胚胎干细胞和胚胎种系细胞二者都能在体外增殖而不分化，它们保留着正常核型和分化产生各种成人类型细胞的能力。然而，已知道人多能干细胞的增殖和分化要遵循的规则比培养的啮齿动物干细胞发育所遵循的大不相同。Geron公司开发了新颖的组织培养条件使得人的多能干细胞能在基本上无饲养细胞的环境中不断增殖，参见澳大利亚专利AU729377和国际专利出版物WO01/51616。能在无饲养细胞环境中培养干细胞提供了一种系统，该系统中用的细胞组合物不难按照人类治疗所规定的要求来制备。为了在人类健康和疾病的治疗中发挥多能干细胞这种潜力、现在必须发展新的方案使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的细胞群，其特征在于，该细胞群中至少约５％的细胞具有与灵长动物多能干（ｐＰＳ）细胞某细胞系相同的基因组；并表达至少一种内源基因的以下标志：　　　　心肌钙蛋白Ｉ（ｃＴｎＩ）、心肌钙蛋白Ｔ（ｃＴｎＴ）或前房利尿钠因子（ＡＮＦ）。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：C徐，
申请(专利权)人：杰龙公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]