一种单克隆抗体，其特征在于该抗体能特异性针对人Ｐ－选择素凝集素－表皮生长因子功能域，与Ｐ－选择素结合。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物工程领域，特别涉及一种人P-选择素凝集素-表皮生长因子(Lectin-EGF，L-EGF)功能域的单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
P-选择素(P-selectin)是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白，定位于血小板的α颗粒和内皮细胞Weibel-Palade小体内，全长由789个氨基酸残基组成。其N末端730个氨基酸构成胞外区，包括1个凝集素(Lectin)结构域、1个表皮生长因子(EGF)结构域和9个补体调节蛋白重复序列(SCR)结构域；C末端24个氨基酸构成跨膜区。此外35个氨基酸构成胞浆短尾(Johnston GI，Cook RG，McEver RP.Cloning of GMP-140，a granulemembrane protein of platelets and endotheliumsequence similarity to proteins involved in celladhesion and inflammation.Cell，1989，56(6)1033-1044)。P-选择素属细胞粘附分子的选择素家族，其作为血小板/内皮细胞活化的标志和粘附受体，可介导白细胞与活化内皮细胞等最初粘附，是启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。其正常情况下不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表达，使原先不表达的脏器也出现表达，故P-选择素参与免疫炎症损伤、血栓形成及肿瘤转移等多种病理生理过程，其过度或持续表达可成为某些脏器病变的标志，与诸多临床疾病有十分密切的关系。实验表明，抑制其表达及其细胞粘附已取得良好的抗炎、抗肿瘤转移等防治效果。为进一步探讨P-选择素的生物学功能及其在炎症等疾病机制中的作用，以及针对其抗粘附治疗意义，近年来P-选择素的分子结构与功能关系研究已引起人们重视。一般认为其胞外区Lectin结构域是P-选择素识别配基并介导细胞间粘附的主要活性部位，但还需胞外区中EGF结构域对其构型的稳定和调节，增强其粘附亲和力与特异性。故Lectin与EGF的共同区域Lectin-EGF可能是P-选择素分子识别和粘附的功能结构域(Mehta，P，Cummings，R.D，andMcEver，R，P.Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoproteinligand-1.J.Biol.Chem.1998，27332506)，但目前尚未制得识别该功能域片段的特异性抗体，不能直接研究和证实Lectin-EGF(L-EGF)区域的功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述课题，提供一种人P-选择素凝集素-表皮生长因子功能域的单克隆抗体；本专利技术的另一目的是提供其制备方法，尤其是生产该单克隆抗体的杂交瘤；本专利技术的再一目的是提供该单克隆抗体的应用。本专利技术的特异性抗人P-选择素L-EGF功能域的单克隆抗体(PsL-EGFmAb)可按下述方法制得。利用特异引物，通过RT-PCR从外周血血小板中扩增出人P-选择素的Lectin-EGF功能域基因，将其克隆至载体中，测序验证后转染大肠杆菌，经诱导表达了C端融合6×His的蛋白质；融合蛋白质经分离纯化后作为抗原，用该抗原免疫哺乳动物，应用杂交瘤技术，筛选阳性克隆，制备腹水及获得目的抗体。其中，上述基因克隆所用的载体一般选用质粒，诸如pET42b(+)；转染的大肠杆菌可选用BL21。上述杂交瘤技术包括按照常规方法免疫，例如皮内注射上述抗原蛋白来免疫哺乳动物，将其脾细胞作为免疫细胞与哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞融合。其中，所说的抗原免疫的哺乳动物较好选择那些在细胞融合中对将要使用的骨髓瘤细胞有适应性的动物，如小鼠，可选用Balb/c小鼠；而骨髓瘤细胞选用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0；将上述免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后，通过间接ELISA筛选阳性克隆；获得3株可稳定分泌抗L-EGF功能域单抗的杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1、F3和H5，其亚型分别为IgG2、IgG1和IgG3，轻链均为κ型，其中细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1已于2003年10月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，获得保藏号为CCTCC-C2003012。对本专利技术所获单抗的特性和功能进行了鉴定与检测表明该单抗对LPS刺激活化的人脐静脉内皮细胞均有特异性结合反应，并可在体外阻断凝血酶激活的血小板与中性粒细胞间的粘附，表明本专利技术的单抗可特异性识别结合天然P-选择素，具有体外抗活化血小板与中性粒细胞粘附的功能；再深入研究表明所述的单抗对肾缺血再灌注损伤有一定的防治功能，为进一步应用此单抗进行揭示P-选择素的结构与功能关系，阐明P-选择素的生理、病理意义，进而为针对其的抗粘附调节与治疗提供手段。另外，该抗体特异性针对人P-选择素L-EGF功能域，与现有抗P-选择素全长的单克隆抗体PsmAb相比，更具有免疫特异性，其抗粘附作用也更强。本专利技术中的杂交瘤细胞株PsL-EGFmAb-CSRJZT-1于2003年10月4日保藏在位于中国武汉大学(邮编为430072)内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，获得保藏号为CCTCC-C2003012。附图说明图1为L-EGF基因的RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定的图谱，M标准分子量(maker)；1、2、3L-EGF基因的RT-PCR产物。图2为酶切和PCR扩增后的重组质粒的分析图谱，MDNA标准分子量；1酶切后的重组质粒产物；2PCR扩增鉴定的产物；3pET42b(+)空质粒。图3A为重组质粒在大肠杆菌中的表达产物的SDS-PAGE检测图谱；M蛋白标准分子量；1IPTG前的菌样品；2IPTG后的菌样品；3经缓冲液C纯化后的蛋白；4经缓冲液D纯化后的蛋白；5经缓冲液E纯化后的蛋白；图3B为纯化后的蛋白经Western blot的分析结果。图4A为未刺激的血小板和中性粒细胞的状态图(400×)；图4B为凝血酶刺激后的血小板和中性粒细胞的粘附状态图(400×)；图4C为经凝血酶刺激的血小板预先用对照单抗处理后和中性粒细胞的粘附状态图(400×)；图4D为经凝血酶刺激的血小板预先用本专利技术的单抗处理后和中性粒细胞的粘附状态图(400×)。图5为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。图6为PsmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。图7为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(HE，×100)。图8为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。图9为PsmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。图10为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h的组织照片(×10,000)。图11为生理盐水对照组肾缺血再灌注6h P-selectin表达的免疫组化照片(×400)。图12为PsL-EGFmAb组肾缺血再灌注6h P-selectin表达的免疫组化照片(×200)。图13为重组质粒pET42b(+)-Lectin-EGF(pET42b(+)-L-E)构建示意图。具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明本专利技术，但并不限制本专利技术的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周同，
申请(专利权)人：上海第二医科大学附属瑞金医院，
类型：发明
国别省市：
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