一种工程蝇凝集素的高效纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其纯化的步骤是：对工程蝇的幼虫进行必要的诱导，待幼虫化蛹后（８０％化蛹），收集蛹，除去饲养中混入的杂质，以生理盐水或者ＢＩＳ做为提取溶剂提取蛹糖蛋白，提取液经离心、超滤、浓缩，吸附色谱柱脱色纯化、离子交换色谱柱纯化、凝胶色谱柱纯化、浓缩等步骤得到一类分子量在６８－２２ｋＤａ之间的糖蛋白。本发明专利技术以工程蝇为原料，工程蝇凝集素有糖结合专一性，其能与色谱柱上的特定配基结合，适合采用特异性纯化，利用色谱分离技术对其进行提取、分离、纯化，并且工程蝇凝集素在４０℃下稳定，适合室温提取，提取方法不仅简单而且实用，适合大规模工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于化学分离
，涉及一种凝集素，尤其是一种工程蝇凝集素的高效纯化方法。
技术介绍
凝集素有多种生物学活性，广泛用于医药、食品、保鲜等行业，凝集素对机体免疫 有双重调节作用，能够促进机体对肿瘤细胞的识别与清除，凝集素单独作用于肿瘤细胞能 够引起肿瘤细胞凋亡，对于病毒在体内复制也有很好的抑制作用，还能促进炎症后机体的 恢复过程。从工程蝇体内提取的凝集素是一种糖蛋白，其生物活性功能与其分子量、分子结 构、糖链的组分都有密切的关系，并使其具有特定的生物学功能，如抗肿瘤特性，对免疫应 答、免疫低下、免疫疾病也有很好的调节作用。 目前工业上运用最为广泛凝集素是刀豆凝集素，但是由于提取得率低而且价格昂 贵，如何高效提取凝集素组分是一亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种提取率高、方法简单的工 程蝇凝集素的高效纯化方法。 本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的 —种工程蝇凝集素的高效纯化方法，纯化的步骤是 (1)对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂 质，清水漂洗，收集漂洗干净的蛹，加提取溶剂研磨，3-5t:静置0. 8-1. 2h，得到浸提液备 用； (2)由步骤(1)得到的浸提液，离心，过滤除去杂质，重复离心、过滤步骤2-4次，收 集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓縮液备用； (3)将步骤(2)得到的浓縮液在4-4(TC条件下与胶混合，每30min缓慢搅拌一次，3. 5-4. 5h后装柱，缓冲液平衡，缓冲液洗脱流速控制在0. 8-1. 2mL/min，洗脱杂蛋白，之后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液流速控制在0. 5mL/min，收集洗脱峰； (4)将收集到洗脱峰过S印hadeXG200凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对各个峰的成分进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末即为凝集素。 而且，所述步骤(1)中幼虫化蛹的化蛹率为80%。 而且，所述步骤(1)的提取溶剂为生理盐水或者昆虫缓冲液BIS。 而且，所述步骤(3)中混胶使用的是S印harose 4B。 而且，所述步骤(4)的缓冲液为昆虫缓冲液BIS。 而且，所述步骤(4)的竞争性洗脱液为D-半乳糖溶液0. 2-0. 3moL/L。 本专利技术的优点和积极效果是 1、本专利技术以工程蝇为原料，工程蝇凝集素具有糖结合专一性，其配基能与凝集素结合，适合采用特异性纯化，利用色谱分离技术对其进行提取、分离、纯化，并且工程蝇凝集 素在4(TC下稳定，适合室温提取，提取方法不仅简单而且实用，适合大规模工业生产。 2、本专利技术提取的工程蝇凝集素是一种具有不同的分子量、结合特异性的大分子物 质，其分子量从68kD-22kD之间，由多种氨基酸组成，冻干后样品为白色粉末，易溶于水，难 溶于有机溶剂，如乙醇、乙醚、甲醛等，保藏方便，再利用方便。附图说明 图1为本专利技术工程蝇蛹提取液的亲和层析图； 图2为本专利技术电泳分析凝集素纯度及分子量非变性电泳，图中M为标准蛋白质样 品；1为经R-250染色的样品； 图3为本专利技术凝集素SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白质样品，I为加入P -巯基乙醇。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。—种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其纯化的步骤是 (1)利用工程蝇传代，得到性状稳定的子代，收集工程蝇子代的蛹，为提高子代繁 殖率与性状稳定，要求饲养环境24°C _301:，湿度控制在60%左右，室内饲养环境达到清洁 级，饲料为高营养、高能量饲料。对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后(80%化蛹)，收 集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，用清水漂洗5次，收集漂洗干净的蛹，以昆虫缓冲液BIS 或者生理盐水做为蛹糖蛋白的提取溶剂，加5倍蛹体积的BIS或者生理盐水进行研磨，4t: 静置lh，得到浸提液备用； 注意用生理盐水做为蛹糖蛋白提取溶剂时，温度应控制在4t:，此时能抑制蛹体 内一些蛋白酶对糖蛋白的降解，以提高产物的得率。 (2)由步骤(1)得到的浸提液，先经过12000rpm离心15min，过滤除去几丁质、脂 肪等杂质，重复离心、过滤步骤3次，收集过滤后的上清液，经过石油醚的抽提，得到的浓縮 液备用； 其中石油醚抽提，处理温度控制在4(TC以下，处理30min以上，可有效除去脂质。 (3)将步骤(2)得到的浓縮液在4°C -4(rC条件下与S印harose 4B琼脂糖凝胶 进行混合，每30min缓慢搅拌一次，4h后装柱，昆虫缓冲液BIS平衡，缓冲液洗脱流速控制 在lmL/min，洗脱杂蛋白，并且亲和目的蛋白，然后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液 D-半乳糖溶液0. 2-0. 3moL/L，流速控制在0. 5mL/min，收集洗脱峰； 其中色谱柱起到除杂蛋白质、亲和目的蛋白的目的，当糖蛋白被洗脱时，可以得 到与单糖有专一性结合的物质。 (4)将收集到的步骤(3)的洗脱液过S印hadeXG200凝胶柱，先后检测到四个峰 值，分别对其进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末为凝集素纯品，其纯度达到90%以上。 其中收集洗脱液通过G-200凝胶注，按分子量大小收集各组分，实验证明各组分 有多种生物学功能，如免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等。4 本专利技术的生物学功能检测实验情况 1、对正常小鼠实验表明，凝集素在非特异性免疫，细胞免疫，体液免疫三方面有 一定调节作用。不同浓度的凝集素对脾脏淋巴细胞增殖能力都具有一定的促进作用。 1200 ii g/mL浓度组具有极显著差异。 2、对于免疫低下小鼠的碳粒廓清实验中，治疗组中，高剂量组有显著性差异。预防 组中，凝集素的作用随剂量的增大而显著，免疫低下小鼠的血清溶血素实验结果表明，高剂 量的凝集素能明显改善免疫低下小鼠的特异性体液免疫能力，而中低剂量组的效果并不明 显。凝集素对于免疫低下小鼠的迟发型超敏反应没有明显作用。 3、体内小鼠实验进一步说明了 ，凝集素对机体免疫水平的调节，无论是在正常小 鼠还是在免疫低下小鼠，凝集素都有一定的作用，对于环磷酰胺所致的免疫低下小鼠有很 好的拮抗作用。 具体检测见如下列表 表1凝集素对正常小鼠免疫器官的影响G士sd， n = 10) <table>table see original document page 5</column></row><table>(与空白对照组比较，*p < 0. 05) 表2凝集素对正常小鼠非特异性免疫功能的影响(；士sd， n = 10)<table>table see original document page 5</column></row><table>(与空白对照组比较，*p < 0. 05， **p < 0. 01) 表3凝集素对正常小鼠体液免疫功能的影响(S士sd， n = 10)<table>table see original document page 5</column></row><table>(与空白对照组比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工程蝇凝集素的高效纯化方法，其特征在于：其纯化的步骤是：　　（１）对工程蝇的幼虫进行诱导，待幼虫化蛹后，收集蛹，除去饲养过程中混入的杂质，清水漂洗，收集漂洗干净的蛹，加提取溶剂研磨，３－５℃静置０．８－１．２ｈ，得到浸提液备用；　　（２）由步骤（１）得到的浸提液，离心，过滤除去杂质，重复离心、过滤２－４次，收集过滤后的上清液；　　（３）将步骤（２）得到的浓缩液混胶，在４－４０℃条件下与胶混合，每３０ｍｉｎ缓慢搅拌一次，３．５－４．５ｈ后装柱，缓冲液平衡，缓冲液洗脱流速控制在０．８－１．２ｍＬ／ｍｉｎ，洗脱杂蛋白，之后进行糖溶液竞争性洗脱，竞争性洗脱液流速控制在０．５ｍＬ／ｍｉｎ，收集洗脱峰；　　（４）将收集到洗脱峰过Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２００凝胶柱，先后检测到四个峰值，分别对各个峰的成分进行回收、冷冻、干燥，得到白色粉末即为凝集素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹小红，周明慧，王爱华，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]