本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)的应用。本发明专利技术利用体外重组表达技术获得了长牡蛎CgCLec-4的糖识别域(CRD)的重组蛋白，长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白在制备抑菌剂或饲料添加剂中的应用。利用本发明专利技术获得的重组蛋白可用于抗菌的饲料添加剂和新型免疫增强剂的开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)的应用。
技术介绍
长牡蛎在世界范围内分布广泛，是重要的海水养殖品种。由于近年来海洋环境日趋恶化，长牡蛎频频爆发大规模死亡事件，海水中的各种微生物病害给长牡蛎养殖业造成了巨大的经济损失。因此，开展牡蛎免疫防御机制的基础研究，对支撑水产业的健康可持续发展具有重要意义。同时,作为软体动物的代表,长牡蛎进化地位较为原始，对无脊椎动物免疫学和比较免疫学的研究意义重大。C型凝集素是一类包含有糖类识别结构域(CRD)并且以钙离子依赖的形式识别并结合糖类的蛋白。除了尾索动物海鞘(H.roretzi)中发现的GBL之外，低等动物中发现了大量具有CTLD的CTL。尽管它们大多缺乏N端的胶原蛋白样结构域，在结构上与高等生物的MBL有一定的差异，但由于含有糖结合结构域，因此具有和高等动物的MBL相似的配体结合功能。它们不仅能够识别病原相关分子模式(Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs)和微生物，还参与了对微生物的吞噬、杀灭和清除。Collectin是一类特殊的C型凝集素，不仅可以参与补体系统的激活，而且在其他免疫应答反应中发挥免疫识别和清除作用。2012年公布的长牡蛎基因组序列表明长牡蛎的基因组中存在着237个C型凝集素，这对于研究低等生物中C型凝集素结构与功能的保守性以及特异性提供了很好的基础。由于缺乏适应性免疫防御系统，长牡蛎主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物，C型凝集素作为一类重要的模式识别受体，能够有效地参与识别表达在微生物表面的病原相关分子模式，并参与对微生物的吞噬、杀灭和清除，在长牡蛎的固有免疫应答中发挥不可或缺的作用。
技术实现思路
本专利技术的在于提供一种长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白的应用。为实现上述目的,本专利技术采用的技术方案为：一种长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白的应用，长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白在制备抑菌剂或饲料添加剂中的应用。所述的长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白在制备抑制抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以或铜绿假单胞菌的抑菌剂中的应用。本专利技术所具有的优点：本专利技术利用体外重组表达技术获得了长牡蛎CgCLec-4的糖识别域(CRD)的重组蛋白，长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白在制备抑菌剂或饲料添加剂中的应用。本专利技术从体外重组表达的长牡蛎凝集素-4(CgCLec-4)蛋白对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性菌大肠杆菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及铜绿假单胞菌有抑制生长作用，作为一种有效的模式识别受体，在开发抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-4能够识别并结合PAMPs和微生物图。图2为本专利技术实施例提供的长牡蛎重组蛋白rCgCLec-4对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、溶藻弧菌以及铜绿假单胞菌生长的影响图。具体实施方式下面的实验例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。本专利技术利用体外重组表达技术获得了长牡蛎CgCLec-4的糖识别域(CRD)的重组蛋白，公开了所述长牡蛎CgCLec-4基因CRD的微生物结合以及抑菌活性。利用本专利技术获得的重组蛋白可用于抗菌的饲料添加剂和新型免疫增强剂的开发。实施例1长牡蛎重组蛋白rCgCLec-4(Genbank号为：XP_011415552)以钙离子依赖的形式识别并结合糖类和微生物1.重组蛋白的构建从NCBI获取CgCLec-4基因的全长，利用基因特异性引物，按照ExTaqDNA聚合酶说明书克隆CgCLec-4，将克隆得到的片段连接到克隆载体pMD19-T。选取测序正确的克隆菌株，选取合适的酶切位点，添加在基因特异性引物的5’端，用于扩增出带有酶切位点的目的片段，使用特异性的限制性内切酶对目的片段进行双酶切。使用T4连接酶(NEB)连接双酶切后的目的片段和表达载体，将连接好的重组表达质粒转化至克隆感受态TOP10中。将成功构建的重组表达质粒转化至表达感受态Transetta(DE3)菌株中，挑取单克隆，接种至带有终浓度为50μgmL-1的氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm，培养至OD600为0.4-0.6，向培养的菌液中加入IPTG使其终浓度为1mmolL-1，37℃培养8小时。离心收集菌体，用上样缓冲液重悬菌体，低温下超声破碎。由于pET-30a(+)表达载体的表达产物中含有6×His标签，因此可利用His侧链上的咪唑基与Ni2+螯合的特性，采用金属离子亲和层析的方法，纯化重组蛋白。引物为：F：GGAATTCCATATGTTTAGAATTGTCCTTGTATTAGTTG，R：CCGCTCGAGCTCGTAGTGTTTTGCTGGTTTC2.重组蛋白的PAMPs结合活性将10μg的LSP,PGN和MAN分别溶于50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中(pH9.6)，每孔100μL包被酶标板，4℃过夜。为了避免非特异性结合加入200μL3％BSA，37℃封闭1h。之后，每孔加入100μL2倍梯度稀释的重组蛋白rCgCLec-4，在加入终浓度为10mMCa2+的条件下18℃孵育3h。加入100μL用3％BSA稀释的大鼠抗his-taq的单克隆抗体(1:1000)，37℃孵育1h。加入100μLHRP标记的羊抗大鼠IgG(1:3000)，37℃孵育1h。每次孵育步骤之间用TBST洗3次，每次5min。二抗孵育并彻底清洗结束后，每孔加入100μLTMB，避光发色30min后，加入50μL2MH2SO4终止发色，酶标仪450nm处读取并记录数值。设rTrx蛋白阴性对照组和TBS空白对照组。每个样品设三个重复，根据3次测定结果取平均值作图(参见图1A)。随着蛋白浓度的升高，各个PAMPs的OD450值逐渐变大，表明对糖的结合能力逐渐增强。该实验表明重组rCgCLec-4蛋白能够识别和结合不同的糖类。2.重组蛋白的微生物结合活性大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌用LB培养基37℃，220rpm，培养到对数生长期时，用Tris-HCl(50mmolL-1,pH＝8.0)稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长牡蛎C型凝集素‑4(CgCLec‑4)重组蛋白的应用，其特征在于：长牡蛎C型凝集素‑4(CgCLec‑4)重组蛋白在制备抑菌剂或饲料添加剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白的应用，其
特征在于：长牡蛎C型凝集素-4(CgCLec-4)重组蛋白在制备抑菌剂
或饲料添加剂中的应用。
2.按权利要求1所述的长牡蛎C型凝集素-4...
【专利技术属性】
技术研发人员：王玲玲，贾志浩，张峘，宋林生，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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