本发明专利技术涉及分子微生物学领域，具体的说是一种C型凝集素(C-type lectin)及其制备和应用。C型凝集素为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：以许氏平鮋cDNA为模板PCR扩增C型凝集素基因，构建质粒pLecC；将pLecC转化大肠杆菌BL21Transetta(DE3)，对转化子进行诱导表达后，收集上清，浓缩后即得重组C型凝集素。所述C型凝集素对多种弧菌具高效凝集作用，经C型凝集素处理后的细菌对许氏平鮋的侵染能力显著降低。因此，该C型凝集素有望应用于鱼类细菌性病害的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及分子生物学及分子微生物学领域，具体的说是一种C型凝集素 (C-type lectin)编码基因及其蛋白制备和应用。
技术介绍
凝集素是一种糖结合蛋白，广泛存在于微生物和动植物中。C型凝集素是凝集素 家族的重要成员，所有的胶原凝素和选择素均属C型凝集素，存在于大多数动物体内。该类 凝集素的主要特征在于他们均含有一个共同的糖识别结构域（carbohy化ate-recognition domain,CRD)。作为一类重要的模式识别受体，C型凝集素可W和微生物表面特定糖分子结 合发挥凝集作用，在宿主对抗微生物侵染的天然免疫中发挥着重要作用。此外，C型凝集 素和病原反应后，可刺激机体产生一系列的免疫反应，包括增强吞瞻作用，趋化作用，刺激 活性氧的产生和细胞因子的释放，部分C型凝集素还可参与树突细胞介导的抗原递呈和吸 收。因此，C型凝集素可在水产养殖业中用作免疫调节剂或病害防治药物。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种C型凝集素编码基因及其蛋白制备和应用。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而 非W任何形式对本专利技术进行限制。 实施例1 本专利技术的C型凝集素蛋白为序列表SEQ ID No. 1中的氨基酸序列，其编码基因为序列 表SEQ ID No. 2中的碱基序列 序列表SEQ ID No. 1为； ADCPEGEASSLKLQL化LRNRF畑LCDQYSNLATNCSAPVIPCAQCPEGWLVVGDQC化LTTD畑DYSNST NKCAEIGAHLAILTTKEQ皿AV邸EGKNIGGIYTYYWIGLTDIETEGDWRWVDNSKLRTPFWEAPEPNNHLSGGPE GEDCAVVQSYTQLWHDVPCSFTYPRICQMDAILPQ (a)序列特征： ?长度；182?类型：氨基酸序列 ?链型：单链 ?拓扑结构；线性 化）分子类型谨白质 (C)假设杏 (d) 反义杏 (e) 最初来源：许氏平触 (f)结构特征；该蛋白预期含有一个CRD结构域（由氨基酸46-175组成）。序列表SEQIDNo. 2 为；(a)序列特征： ?长度；576 ?类型：碱基序列 化）分子类型基因 (C)假设杏 (d) 反义杏 (e) 最初来源：许氏平触 实施例2 C型凝集素的制备方法： (1)质粒pLecC的构建； 对C型凝集素编码基因对应的氨基酸序列进行分析，W去除编码信号肤和终止密码 的基因序列为模板设计正向引物LecCFl和反向引物LecCRl。W许氏平触cDNA为模板， 用引物LecCFl和LecCRl进行PCR扩增。PCR条件为；94°C60s预变性模板DNA，然后 94°C40s, 54°C60s, 72°C40s, 5 个循环后改为 94°C40s,6TC60s, 72°C40s, 25 个循环后再 在72°C延伸反应7min。PCR产物纯化后与载体祀as厂T1 (购于"全式金（北京）生物技 术有限公司"）于室温连接10分钟，连接混合液转化大肠杆菌后在含氨节青霉素（100yg/ ml)、Xgal(40yg/ml)、异丙基-0 -D-硫代半乳糖巧（24yg/ml)的LB培养基上培养18 -24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pTlLecC。 将上述质粒pTlLecC和质粒祀T259(质粒祀T259构建过程参见化engWJ，化 YH,SunL.Cloningandanalysisofaferritinsubunitfromturbot(Scophthalmus maximus).FishShellfishImmunol.2010a;28 巧- 6),829 - 836.)分别用限制性内切酶 EcoRV和Swal酶切后回收0. 58化和5. 4化片段，将该二个片段用T4DNA连接酶连接，连接 液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素（50yg/ml)的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转 化子提取质粒，即为pLecC。所述LecCFl为 5 ' -gatatcCTCATCGGCTTGTTGGC-3'；LecCRl为 5> -gatatcCTGGGGCAGGATGGC-3>。 (2) C型凝集素的表达和制备： 将步骤（1)的质粒pLecC转化大肠杆菌化21Transetta〇)E3)(购于"全式金（北京） 生物技术有限公司"），在含50yg/ml的卡那霉素和50yg/ml的氯霉素的LB培养基上培 养，筛选转化子即为化21/pLecC。将化21/pLecC于含有卡那霉素和氯霉素的LB培养基 中于37°C培养至孤e。。为0.6,加入ImM的异丙基-0 -D-硫代半乳糖巧，37°C继续振荡培 养 4-5 小时，而后用GEHealthcare(美国）公司的nickel-nitrilotriaceticacid亲和 层析柱纯化重组蛋白。将纯化的重组蛋白进行N-端氨基酸测序，证实其分别为序列表SEQ IDNo. 1中氨基酸序列所示的C型凝集素。 (3)C型凝集素对细菌的凝集活性 创伤弧菌和鱼肠道弧菌制备。在LB培养基中培养创伤弧菌和鱼肠道弧菌分别至 0D600为0. 5,然后室温离屯、10分钟，收集菌体，将其悬浮于TBS-化化缓冲液巧OmM Tris-Cl,lOOmM化Cl,lOmMCaC12，pH7. 5)中至终浓度为 2xl09cfu/ml。 凝集素LecC的凝集活性。将10y1上述菌液与等量的LecC巧00yg/mU或？85 (对 照）混合，25°C保温1小时。随后将混合液滴于载玻片上，于显微镜下观察。观察结果显示 重组C型凝集素对于创伤弧菌和鱼肠道弧菌有较强的凝集效果。 (4) C型凝集素在病害防治中的应用 将10条大菱解（每条重约lOg)随机分为2组，每组5条。将该2组分别命名为A和B组。将3)中制备的创伤弧菌在TBS-化化缓冲液中重悬至2xl06c化/ml,取50 y 1菌悬液， 加入50 y 1重组C型凝集素至终浓度为500 y g/ml或PBS(对照），25°C保温比。随后将A 组的每条鱼腹腔注射100 LecC和创伤弧菌的混合液。将B组（对照组）的每条鱼腹腔 注射100 y 1 PBS和创伤弧菌的混合液。12小时后将A和B组鱼麻醉后取肝脏组织，称重 后匀浆，将匀浆液涂布于LB固体平板，28°C培养32 - 48小时。菌落计数发现，与PBS组相 比，重组C型凝集素处理导致创伤弧菌对许氏平触的侵染能力降低93. 5%。因此，该C型凝 集素可望应用于鱼类细菌性病害的防治。[001引表一、LecC对创伤弧菌侵染能力的影响（X104CFU/g)【主权项】1. 一种C型凝集素蛋白，其特征在于，C型凝集素蛋白为序列表SEQ ID No. 1中的氨基 酸序列所示。2. 权利要求1所述C型凝集素蛋白的编码基因，其特征在于，所述C型凝集素蛋白编码 基因的DNA序列如SEQ ID No. 2所示。3. -种权利要求1所述C型凝集素蛋白的制备，其特征在于 (1) 质粒pLecC的构建 以许氏平触cDNA为模板，用引物LecCFl和LecCRl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与 载体pEasy-Tl构建成质粒pTILecC，将pTILecC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种C型凝集素蛋白，其特征在于，C型凝集素蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张敏，岳斌，赵鑫鹏，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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